Nachweis und Quantifizierung von kolorektalen Tumorzellen in peripherem Blut mittels Real-time PCR

Abstract

Hintergrund: Der quantitative Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen durch die RT-PCR ist immer noch mühselig, und die meisten Marker, die als Objekte der RT-PCR benutzt werden, sind entweder nicht tumorspezifisch oder nicht sensitiv genug oder beides. Wir untersuchten anhand eines Real-time RT-PCR Ansatzes zwei neue Marker und CEA. Ziele: Wir wollten einen quantifizierbaren Real-time Reversen Transkriptions (RT) Polymerasekettenreaktions (PCR) Ansatz zum Nachweis zirkulierender kolorektaler Tumorzellen etablieren und herausfinden, ob Protease M oder Colon carcinoma specific gene 1 (Ccsg1) dem Carcinoembryonalen Antigen (CEA) hierbei als Tumormarker überlegen sind. Untersuchungsgut und Methodik: Wir haben einen für Protease M und CEA spezifischen Real-time RT-PCR Ansatz entwickelt und diesen durch die in Titrationsexperimenten mit Protease M und CEA positiven Zellen in Gesundblut gewonnenen Ergebnisse verbessert. Mithilfe des gewonnenen Protokolls untersuchten wir Blut (n=24) und Tumorgewebe (n=9) von Patienten mit kolorektalem Karzinom. Die Spezifität wurde anhand der Untersuchung von gesundem Blut (n=7) und gesundem Kolongewebe (n=6) bestimmt. Ergebnisse: In unseren Titrationsexperimenten konnten wir Protease M im Vergleich zu CEA drei Zehnerpotenzen an Tumorzellen früher detektieren. Von den sieben Gesundblutproben war eine (14%) CEA mRNA-positiv und keine Protease M (0%) oder Ccsg1 (0%) positiv. Die Expression von Protease M und CEA variierte in gesundem - und neoplastischem Gewebe stark. Protease M wurde im Gegensatz zu CEA in Tumorgewebe höher exprimiert als in gesundem Gewebe. In Patientenblutproben korrelierte die Expression von Protease M-mRNA nicht mit der von CEA-mRNA (p=0,88). Unser interner Standard war dem Vergleich mit PBG-D nicht überlegen. Auswertung: Mit Protease M-mRNA lassen sich zirkulierende kolorektale Tumorzellen in einem Real-time RT-PCR Ansatz nachweisen und quantifizieren. Ob Protease M hierbei sensitiver oder spezifischer als CEA ist, müssen nachfolgende Arbeiten untersuchen.

Background: quantifiable detection of circulating cancer cells by RT-PCR ist still laborious, and most markers, being used as targets for RT-PCR, are either not specific or not sensitive enough or both. We investigated two new targets and CEA in a real-time RT-PCR assay. Aims: To establish a quantifiable real-time reverse transcription (RT) polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of circulating colorectal cancer cells, and to assess, whether protease M or colon carcinoma specific gene 1 (ccsg 1) are superior to carcinoembryonic antigen (CEA). Methods: We developed an assay exclusively for protease M and CEA and improved this assay in titration experiments. The protocol was used to investigate blood (n=24) and neoplastic tissue (n=9) from patients with colorectal cancer. Specificy was determined by investigation of blood (n=7) and tissue of healthy volunteers (n=6). Results: In our titration experiments we were able to detect protease M a thousand times of cancer cells earlier than CEA. Of the seven samples of heathy volunteers, one was positive for CEA-mRNA (14%) while none was either positive for protease M (0%) or ccsg 1(0%). Expression levels of protease M and CEA spread widely in normal and neoplastic tissue. Expression of protease M-mRNA did not correlate with that of CEA-mRNA in patient blood samples (p=0,88). Internal standard was not superior to normalization with PBG-D. Conclusion: circulating colorectal cancer cells are detectable and quantifiable by real-time RT-PCR for protease M. Following studies have to show whether protease M is more specific or sensitive than CEA in this regard.