Die Auswirkungen von Erythropoietin auf die Ischämie/Reperfusionsschäden der Fettleber nach orthotoper Lebertransplantation am Rattenmodell

Abstract

Der Mangel von geeigneten Spenderorganen stellt eines der Hauptprobleme in der heutigen Transplantationschirurgie dar. Dieser Umstand zwingt den Chirurgen immer öfter zur Akzeptanz von „marginalen“ Organen. Diese qualitativ schlechteren Transplantate sind vermehrt mit einem primären Transplantatversagen, einer primären Transplantatdysfunktion und einem verringerten Empfängerüberleben assoziiert. Tierexperimentelle Untersuchungen konnten bereits mehrfach die positiven Auswirkungen von rekombinantem humanen Erythropoietin (rhEPO) gegenüber verschiedenen Organsystemen demonstrieren. In diesem Zusammenhang konnte der protektive Einfluss von rhEPO gegenüber Ischämie/Reperfusionsschäden in der Leber, der Lunge und dem Gehirn nachgewiesen werden. Diese Arbeit hat es sich zum Ziel gemacht die Auswirkungen von Erythropoietin auf die Ischämie/Reperfusionsschäden der Fettleber nach orthotoper Lebertransplantation am Rattenmodell zu beleuchten. Es wurden insgesamt 140 Lewis Ratten verwendet und 70 Lebertransplantationen am Rattenmodell durchgeführt. Zur Induktion einer Fettleber (Verfettung >50%) wurde eine Methionin-Cholin-Defizit-Diät (MCDD) bei allen 70 Spendertieren angewendet. Die Behandlungsgruppen bestanden aus 60 Spender– und Empfängertieren und diese erhielten jeweils 4000 Einheiten rhEPO pro Kilogramm Körpergewicht portalvenös injiziert. Die anderen 80 Spender- und Empfängertiere der Kontrollgruppen erhielten jeweils eine portalvenöse Injektion mit Kochsalzlösung. Die Injektionen erfolgten eine halbe Stunde vor der Organentnahme in der Spendergruppe und direkt nach der Organreperfusion in der Empfängergruppe. Bei sämtlichen Transplantaten wurde eine Kaltischämiezeit von 6 Stunden eingehalten und die Organe wurden mit der University of Wisconsin-Lösung konserviert. Die Tiere wurden 4,5, 24 und 48 Stunden, sowie 7 Tage nach der Reperfusion getötet. Zwei Stunden nach der Reperfusion war bei den Tieren die 4,5 Stunden nach Reperfusion getötet wurden, eine Resektion des Lobus triangulatus zur histologischen und molekularbiologischen Aufbereitung durchgeführt worden. Von sämtlichen Tieren wurde zum Tötungszeitpunkt Blut- und Lebergewebe asserviert. Es erfolgten Laboranalysen der Leberenzyme (AST, ALT, LDH, GLDH), histologische Untersuchungen (H.E.-, PAS-Färbung), sowie immunhistologische Analysen (TUNEL, Hypoxyprobe™, TNF-α) und Bestimmungen der mRNA-Expression bestimmter Zytokine mittels Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (HGF, HIF-1α, IL-1 β, IL-6, TNF-α, VEGF). Die kumulative Überlebensrate der Tiere die mit rhEPO behandelt worden sind, war signifikant höher, als die der Tiere die nur mit Kochsalzlösung behandelt wurden. RhEPO vs. NaCl: 86,6% (n=30; 26 überlebt/4 gestorben) vs. 65% (n=40; 26 überlebt/14 gestorben) (p=0,031). Sämtliche verstorbenen Tiere kamen circa innerhalb der ersten 4 Stunden nach der Operation zu Tode und wiesen in der Obduktion alle Zeichen eines hyperakuten Transplantatversagens auf. Der beobachtete signifikante Überlebensvorteil unter rhEPO-Applikation, stimmt somit mit vielen bis dato publizierten tierexperimentellen Studien überein (114-116). Die ALT- und AST- Aktivität im Plasma war in der mit rhEPO behandelten Gruppe 48 Stunden nach der Reperfusion des Transplantates, signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe. Alle anderen gemessenen Leberenzyme zeigten sehr uneinheitliche Ergebnisse auf. Der prozentuale Anteil des nekrotischen Lebergewebes konnte weder in der Kontroll- noch in der Behandlungsgruppe ein eindeutiges Ergebnis erbringen. Die immunhistologische Hypoxyprobe™-Färbung zeigte signifikant niedrigere hypoxische Zellen 4,5 Stunden nach Reperfusion in der rhEPO-Gruppe auf. Es wurde eine signifikant verringerte Apoptoserate in der rhEPO-Gruppe nach 4,5 Stunden festgestellt. Fast sämtliche Zytokine konnten keine signifikanten Ergebnisse aufweisen. Lediglich die TNF-α Expression war in der rhEPO-Gruppe nach 48 Stunden signifikant reduziert. Die VEGF mRNA-Expression war in der rhEPO-Gruppe ergänzend dazu nach 4,5 Stunden signifikant erhöht. Zudem konnte der Nachweis eines signifikanten Überlebensvorteils für die mit rhEPO behandelten Tiere erbracht werden. RhEPO verringert die Ischämie/Reperfusionsschäden und verbessert in Verbindung mit einer gesteigerten Geweberegeneration das Überleben, im Rahmen der Transplantation einer Fettleber bei der Ratte.

The scarcity of appropriate donor organs represents one of the main problems in the present transplantation surgery. This circumstance forces the surgeon to accept so-called marginal organs more often. These qualitatively limited grafts are associated with higher rates of primary nonfunction or dysfunction and reduced recipient survival. Investigations in animals demonstrated positive effects of recombinant human Erythropoietin (rhEPO) in various organ systems already. The protective influence of rhEPO has been proven by decreased ischemia-reperfusion injury in liver, lung and brain. This work analyzed the effect of rhEPO on ischemia-reperfusion injuries of the fatty liver after orthotopic liver transplantation in a rat model with a cold- ischemia time of six hours. 140 Lewis rats were used to perform 70 liver transplantations in rats. A Methionin-choline-deficit-diet (MCDD) was used to induce a fatty liver (>50% steatosis) in all 70 donor animals. 60 donor and recipient animals received 4000 units of rhEPO/kg body weight into the portal vein (rhEPO-Group). The other 80 donor and recipient animals received an injection with saline solution (Control-Group). Donors were injected into the portal vein 30min before harvest and recipients directly after reperfusion of the liver. Cold ischemia time of 6 hours was kept in all grafts and the organs were conserved with University of Wisconsin solution. Animals were sacrificed 4,5, 24, 48 hours, and 7 days after reperfusion for collection of serum and liver tissue. The animals which were sacrificed after 4,5 hours underwent a small-sized liver resection for histological and molecular-biological investigations two hours after organ reperfusion. Analysis of liver enzymes (AST, ALT, LDH, GLDH), histology (hematoxylin-eosin and periodic acid Schiff stain), immunostaining (terminal deoxynucleotide tranferase-mediated dUTP nick-end labeling, hypoxyprobe, and tumor necrosis factor-α) and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of cytokine messenger RNA (interleukin-1, interleukin-6, hypoxia induced factor-1α, vascular endothelial growth factor, and hepatocyte growth factor) were performed. For all animals that were scheduled to survive longer than 4 hr after liver transplantation, cumulative survival was determined. RhEPO-treated rats had significantly improved survival compared with controls: RhEPO vs. NaCl: 86,6% (n=30; 26 survived/4 died) vs. 65% (n=40; 26 survived/14 died) (p=0,031). All deceased animals died approximately within the first 4 hours after the operation and had all signs of a hyperacute graft failure. The observed significant survival advantage by rhEPO application could also been proven and was published in other studies (114-116). Liver enzyme levels (ALT and AST) in the plasma were significantly reduced in rhEPO-treated animals after 48 hours. All other measured liver enzymes showed very different results. Different necrotic cell rates between rats of the control group compared to rhEPO-treated rats were without significance. Hypoxyprobe-immunostaining displayed significantly less hypoxic alteration in rhEPO-treated graft hepatocytes after 4,5 hours. A significantly reduced apoptotic cell rate was detected in the rhEPO-group after 4,5 hours. No significant results could be shown in almost all cytokines. Only TNF-α expression was reduced significantly in the rhEPO group after 48 hours. The mRNA expression of VEGF was increased significantly in rhEPO treated animals after 4,5 hours. Furthermore the proof of a significant survival improvement in rhEPO treated rats could be given. In sum, rhEPO reduces ischemia-reperfusion injuries and improves hepatic tissue regeneration. In conclusion, rhEPO improves survival significantly after orthotopic transplantation of fatty livers in rats.