Untersuchungen zur Wirksamkeit einer Immunmodulation mit IL-4 bei CVB3-induzierter akuter Myokarditis in BALB/c-Mäusen

Abstract

Die myokardiale extrazelluläre Matrix ist ein komplexes Netzwerk aus Strukturproteinen und sorgt durch die strukturelle Integrität und Koordination der Myozyten entscheidend für eine suffiziente hämodynamische Funktion. Pathologisches Remodeling führt zur Störung dieses Gefüges und kann im Verlauf der akuten Myokarditis den Übergang zur dilatativen Kardiomyopathie bewirken. Aufgabe dieser Arbeit war die Untersuchung des matrixregulierenden Systems aus MMP / TIMP und der Entzündungsreaktion sowie deren Beeinflussung durch eine Immunmodulation mittels exogen zugeführten IL-4 bei akuter experimenteller CVB-3-induzierter Myokarditis. Dazu wurde in acht Wochen alten männlichen BALB/c-Mäusen durch intraperitoneale Injektion von 150000 PFU Coxsackievirus-B3 (Nancy Strain) eine akute virale Myokarditis ausgelöst. 8 unbehandelte Kontrollen und 8 infizierte Mäuse dienten als Ausgangsniveau der Myokarditis. Für eine Induktion einer Th2-Immunantwort wurden weitere 16 Tiere mit 200 ng/d rmIL-4 behandelt. Davon 4 nicht-infizierte Mäuse über 10 Tage und jeweils 4 infizierte Tiere vom 0.-5. bzw. 6.-10. bzw. 0.-10. Tag p.i. Versuchsende war für alle Tiere der 10. Tag p.i. Der Erfolg der Virusinfektion wurde durch Nachweis enteroviralen Genoms im Myokard mittels seminested-PCR und die Auswirkung der IL-4-Immunmodulation mittels hämodynamischer Untersuchung verifiziert. Die Entzündungsreaktion wurde durch immunhistochemische Färbung von CD3+-, CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten sowie von Makrophagen analysiert und die mRNA-Expression von IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6 und TGF-beta1 durch semiquantitative RT-PCR bestimmt. Um die Auswirkung der Entzündungsreaktion auf das Myokard zu klären, wurde das myokardiale Schädigungsmuster durch Luxol Fast Blue-Färbung analysiert. Veränderungen im MMP-/TIMP-System wurden durch Ermittelung der mRNA-Expression von MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13, MT1-MMP, EMMPRIN und TIMP-1-4 in den einzelnen Versuchsgruppen bestimmt, und an der endogenen Expression von beta-Aktin relativiert. Der Nachweis einer posttranslationalen Aktivierung der MMP erfolgte durch Gelatin-Zymographie. Ferner wurde das mRNA-Expressionsmuster von IL-6, TGF-beta1, MMP-3 und TIMP-1 mittels RNA:RNA-in-situ Hybridisierung direkt im Myokardgewebe untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Erhöhung der Zytokinexpression mit Prädominanz der Th1-Immunantwort durch die virale Infektion. Ebenso war ein deutliches Überwiegen der MMP- gegenüber der TIMP-Expression im Sinne eines pathologischen Matrixumbaus mit linksventrikulärer Dysfunktion nachweisbar. Unter Immunmodulation mit IL-4 kam es zu einer Suppression der Th1-Antwort mit Anstieg der Th2-Zytokine und nahezu Nivellierung der infektionsbedingten Dysbalance im MMP-/TIMP-System. Durch die Behandlung konnte die Infiltratzusammensetzung in Richtung des CD4+-Phänotyps verschoben werden, was allerdings zu einer Zunahme myofibrillärer Veränderungen führte. Alle diese Befunde waren insbesondere bei frühzeitiger IL-4-Applikation nachweisbar und führten zu einer deutlichen Besserung der linksventrikulären Funktion, während andere Applikationsschemata eine nur geringe Beeinflussung zeigten. Eine frühzeitige IL-4-Therapie kann daher bei akuter viraler Myokarditis durch Induktion einer Th2-Immunantwort und Stabilisierung des MMP-TIMP-Gleichgewichts eine infektionsbedingte kardiale Depression verhindern.

The myocardial extracellular matrix is a complex network of structure proteins and ensures sufficient hemodynamical function by structural integrity and coordinated myocyte contraction. Pathological remodelling destroys this network and facilitates the transition from acute myocarditis to dilatative cardiomyopathy. The purpose of this study is to investigate the matrix- controlling MMP / TIMP system, to characterize the inflammatory response in experimental acute CVB3 induced myocarditis, and to study the impact of IL4 therapy on these parameters. Eight week old male BALB/c mice were intraperitoneally infected with 150,000 PFU coxsackie virus B3 (Nancy strain) to cause acute viral myocarditis. Eight sham-infected non-treated and 8 infected non-treated served as baseline for studying viral myocarditis. To activate a Th2 immune response, an additional 16 mice were treated with 200 ng/d rmIL4 intraperitoneally (sham-infected and treated for 10 days, n=4; infected and treated for 10 days, n=4; infected and treated from days 0-5, n=4; infected and treated from days 6-10). End of study was the 10th day post- infection for all mice. The success of viral infection was tested by semi- nested PCR for the presence of viral genome in myocardial tissue. Hemodynamical alterations and response to IL4 treatment was tested by cardiac catheterisation. Immunhistochemical staining for CD3+, CD4+, CD8+ T lymphocytes and macrophages (MAC-3) was used to characterize the inflammatory response, and mRNA expression of different cytokines (IL1beta, IL2, IL4, IL6, and TGFbeta1, respectively) was analysed by semi-quantitative RT-PCR. Myocardial damage was assessed by a modified Luxol Fast Blue staining. Alterations in the MMP/TIMP system were measured by mRNA expression analysis of MMP2, MMP3, MMP9, MMP13, MT1MMP, EMMPRIN, and TIMP 1 to 4, respectively. Gelatinase activity was tested by gelatine zymography. RNA:RNA in situ hybridization was performed for IL6, TGFbeta1, MMP3, and TIMP1 in myocardial tissue samples. In non-treated viral myocarditis the mRNA expression of Th1-related cytokines and MMP was significantly increased, while mRNA expression of the TIMP was suppressed. These alterations induced matrix degradation and left ventricular dysfunction. In IL4 treated mice, the increase of mRNA expression of Th1-related cytokines and MMP and the suppression of TIMP was less pronounced as compared to non-treated infected mice. Although the cellular infiltrate was switched to CD4+ T lymphocytes, IL4 treatment resulted in more distinctive myocardial damage. All these changes were particularly found in IL4 treatment at an early stage of disease, while alterations in other application schemes were less pronounced. Treatment by IL4 at an early stage of acute viral myocarditis could induce a Th2 immune response and may prevent cardial dysfunction by stabilizing the MMP/TIMP system and decreasing pathological remodeling.