Synaptophysin/Synaptobrevin complex: Characterisation of the Ca2+-dependent cytosolic dissociation of the complex

Abstract

Neurotransmission is highly dependent on the regulated release of neurotransmitters at the presynaptic terminal. This release is stringently regulated by numerous proteins of which several have been characterised and linked to precise functions in the regulation of neuroexocytosis. Synaptophysin (Syp) and synaptobrevin (Syb) are the most abundant proteins at the presynapse. While the role of Syb in neurotransmission is clear, that of Syp has remained widely elusive. Along with its t-SNAREs partners (Syntaxin and SNAP25), the v-SNARE (Syb) forms the SNARE fusion complex which is widely accepted to be the core component of neuroexocytosis. However, Syb also forms another complex with Syp known as the Syp/Syb complex. Both complexes are mutually exclusive. In spite of its abundance, the role of the Syp/Syb complex during neuroexocytosis is not yet clear. The present study focuses on the putative interaction between Syp and Syb and the characterisation of the Ca2+-dependent dissociation of this interaction. To study the complex we first evaluated the detection of the complex using two different methods: 1.) Crosslinking with disuccinimidyl suberate (DSS) and 2.) immunoprecipitation using antibodies against Syp or Syb. Our results showed that both methods are successful in the detection of the Syp/Syb complex. Furthermore, the results obtained for both methods are comparable. Subsequently, the effect of Ca2+ on the Syp/Syb-complex was investigated. The following results were obtained: 1.) Ca2+ only or in combination with EGTA does not dissociate the interaction between Syp and Syb. 2.) Both Ca2+ and synaptic cytosol must be present for the dissociation of the Syp/Syb complex to occur. 3.) The dissociation does not depend on the amount of Ca2+ used but rather on its presence. The fact that the complex dissociated to the same degree with Ca2+ concentrations of physiological relevance (micromolar range, µM) suggests an intrinsic role for Ca2+ rather than a mere ionic disruption, as might be rightfully expected for higher Ca2+ concentrations. In a distinct setup to verify the reassociation of the complex, we observed an increase in the detection of the complex when synaptic vesicles (SVs) prepared in the presence of Ca2+ were reconstituted in Ca2+-free cytosol as compared to reconstitution with cytosol containing Ca2+. Taken together, these results suggest a cytosolic factor whose effect on the complex is regulated by the presence or absence of Ca2+. Attempts to characterise and isolate the cytosolic factor responsible for dissociation of the Syp/Syb complex have so far stalled. However, the results obtained indicate a factor of molecular weight greater than 30kDa. Furthermore, freezing and thawing as well as temperatures as high as 95°C do not affect the integrity of the factor.

Neurotransmission ist abhängig von der regulierten Freisetzung von Neurotransmittern an der Präsynapse. Diese Freisetzung wird von mehreren Proteinen reguliert. Viele dieser Proteine sind näher charakterisiert und ihre Beteiligung an der Regulation der Neuroexozytose beschrieben worden. Synaptophysin (Syp) und Synaptobrevin (Syb) sind die am häufigsten vorkommenden Proteine synaptischer Vesikel. Während die Rolle von Syb innerhalb der Neuroexozytose vergleichsweise klar ist, ist die Rolle von Syp weitgehend unklar geblieben. Syb bildet zusammen mit seinen t-SNARE Bindungspartnern Syntaxin (syx) und SNAP25 den SNARE-Komplex, der grundsätzlich als eine Kernkomponente der Neuroexozytose angesehen wird. Syb bildet einen weiteren Komplex mit Syp, den sogenannten Syp/Syb-Komplex. Beide Komplexe schließen einander aus. Trotz seiner hohen Konzentration ist die Rolle des Syp/Syb-Komplexes bei der Neuroexozytose umstritten. Die vorliegende Studie beleuchtet insbesondere die Ca2+-abhängige Dissoziation der Interaktionspartner Syp und Syb. Es wurden zwei Methoden zur Detektion des Komplexes evaluiert: 1.) Quervernetzung mit Disuccinimidylsuberat (DSS) und 2.) Immunopräzipitation mit Antikörpern gegen Syp oder Syb. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden zur Detektion des Syp/Syb-Komplexes erfolgreich eingesetzt werden können und vergleichbare Resultate liefern. In weiteren Versuchen wurde die Wirkung von Ca2+ auf die Stabilität des Syp/Syb- Komplexes untersucht und folgendes beobachtet: 1.) Ca2+ allein oder in Verbindung mit EGTA führt nicht zur Dissoziation des Syp/Syb- Komplexes. 2.) Für die Dissoziation des Komplexes werden sowohl Ca2+ als auch synaptisches Zytosol benötigt. 3.) Die Dissoziation durch Ca2+ ist konzentrationsunabhängig. Die Tatsache, dass der Komplex bei physiologisch relevanten Ca2+ konzentrationen (im mikromolaren Bereich, µM) genauso gut dissoziiert, schließt eine Dissoziation aufgrund von ionischen Wechselwirkungen wie sie bei hohen Ca2+ konzentrationen zu erwarten wäre, aus. In weiteren Experimenten wurde die Reassoziation des Komplexes untersucht. Hierbei kann eine verstärkte Komplexbildung bei unter Ca2+-bedingungen preparierten synaptischen Vesikeln (SV) beobachtet werden, die in Kalzium-freiem Zytosol resuspendiert werden im Gegensatz zu SV die unter dergleichen Bedingungen prepariert wurden und in Ca2+-haltigen Zytosol resuspendiert werden. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf einen zytosolischen Faktor hin, dessen Wirkung auf den Syp/Syb- Komplex Ca2+-abhängig zu sein scheint. Bemühungen, diesen Faktor näher zu charakterisieren und zu isolieren führten bisher zu keinem entgültigem Ergebnis. Die dabei erzielten Befunde belegen aber, dass der Faktor ein Molekulargewicht von mindestens 30kDa besitzt und dass Frier- und Auftau- Zyklen, sowie Temperaturen von bis zu 95°C keinen Einfluss auf die Integrität des Faktors haben.