Background: Cerebral malaria is the most severe manifestation of Plasmodium falciparum malaria. Sensing of Plasmodium-specific pathogen-associated molecular patterns such as glycosylphosphatidylinositol (GPI) by the host pattern recognition receptors leads to the induction of pro inflammatory pathways, and has been shown to be a major contributor to cerebral malaria pathogenesis. Carbohydrate-based vaccines have widely been applied and successfully prevented disease and death in recent decades. An antitoxic GPI glycoconjugate vaccine therefore represents a promising approach to preventing cerebral malaria pathogenesis. Method: Six structurally distinct GPI glycans were synthesized and conjugated to CRM197. GPI1 and GPI2 both containing Man3-GlcN, with PEthN attached to GPI2; GPI3 and GPI4 core structures containing Man4-GlcN, with PEthN attached to GPI4; and GPI5 (Man3-GlcN) and GPI6 (Man4 GlcN) both containing PEthN and PI. Glycoconjugates were tested for immunogenicity and efficacy in C57BL/6JRj mice susceptible to experimental cerebral malaria (ECM). Mice were immunized three times intraperitoneally at 14-day intervals and were finally challenged with 1x106 erythrocytes infected with P. berghei ANKA (PbA). Serum samples were obtained before immunizations to determine anti GPI antibody level. Prior to onset of ECM (day 6 post infection), 5 mice per group were sacrificed to investigate spleen cell composition, brain T cell sequestration and vaccine specific T cell re- stimulation. The remaining 10 mice per group were used for survival studies. Results: Mice immunized with GPI2, GPI4, GPI5 and GPI6 developed significantly increased anti GPI antibodies compared to control mice. Only a slight increase was observed in mice immunized with GPI1 and GPI3. Control mice succumbed to experimental cerebral malaria in 100% of cases, whereas all GPI- CRM197-immunized mice displayed an improved survival. In particular, GPI5-vaccinated mice were significantly protected against PbA-induced encephalopathy with 40% survival. Immunological characterization of spleen cell population and serum cytokines did not reveal significant differences between GPI-CRM197-vaccinated groups. However, distinct trends were observed, with GPI5 showing decreased cellular activation and reduced levels of serum cytokines TNF-α, IFN-γ and IL-6. Conclusion: In this study, the efficacy and immunogenicity of structurally distinct GPI glycoconjugate vaccines was investigated. For the first time, the approved non-toxic mutant of diphtheria toxin CRM197 and alum were applied in this glycoconjugate formulation. A structure activity relationship of different synthetic GPIs with respect to immunogenicity by glycan array analysis was established. Further, the effectiveness of the GPI-antitoxic vaccine approach could be reproduced with a diminished pro inflammatory immune response against Plasmodium GPI, preventing disease pathology and death in some of the glycoconjugates tested. In conclusion, this study adds to current evidence that a GPI-antitoxic vaccine provides protection against Plasmodium GPI-induced ECM.
Hintergrund: Die zerebrale Malaria gehört zu den schwersten Verlaufsformen der durch Plasmodium falciparum verursachten Malaria tropica. Die Erkennung von pathogen-assoziierten molekularen Mustern, wie beispielsweise parasitäres Glykosylphosphatidylinositol (GPI) durch Mustererkennungsrezeptoren, führt zur Induktion einer proinflammatorischen Reaktion des Wirtes. Dieser konnte eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der zerebralen Malaria nachgewiesen werden. Kohlenhydrat-basierte Impfstoffe sind ein essentieller Bestandteil der aktuell zugelassenen Vakzine und spielen eine wichtige Rolle in der Prävention von Infektionskrankheiten. Ein antitoxischer GPI-Glykokonjugat-Impfstoff ist daher ein vielversprechender Ansatz zur Prävention der zerebralen Malaria. Methode: Sechs strukturell verschiedene GPI-Glykane wurden synthetisiert und an CRM197 konjugiert: GPI1 und GPI2 jeweils basierend auf Man3-GlcN, mit PEthN zusätzlich an GPI2 gebunden; GPI3 und GPI4 basierend auf Man4-GlcN, mit PEthN an GPI4 gebunden; sowie GPI5 (Man3-GlcN) und GPI6 (Man4-GlcN) jeweils mit PEthN und PI versehen. Alle Glykokonjugate wurden an für die experimentelle zerebrale Malaria (ECM) empfänglichen C57BL/6JRj Mäusen hinsichtlich Immunogenität und Wirksamkeit getestet. Die Immunisierung wurde intraperitoneal in 14-tägigen Abständen appliziert und den Versuchstieren anschließend 1x106 P. berghei ANKA (PbA) infizierte Erythrozyten injiziert. Serumproben wurden vor den Immunisierungen entnommen. 5 Mäuse wurden zur detaillierten Analyse von Milzzellpopulationen, zerebraler T Zell Sequestrierung und Impfstoff-spezifischen T-Zell Re-stimulation vor Auftreten ECM spezifischer Symptome (Tag 6 post infectionem) pro Gruppe verwendet. Mit den verbleibenden 10 Mäusen wurde die Wirksamkeit der Impfstoffe mittels Überlebensstudien durchgeführt. Ergebnisse: GPI2, GPI4, GPI5 und GPI6 immunisierte Mäuse entwickelten signifikant höhere anti GPI Antikörper im Vergleich zu Kontrolltieren. Für GPI1 und GPI3 konnte nur ein leichter Anstieg beobachtet werden. Insgesamt war die Prävalenz der ECM bei den Kontrollmäusen 100%, wohingegen alle GPI CRM197 immunisierten Mäuse eine verbesserte Überlebensrate aufwiesen. Insbesondere konnte bei GPI5 geimpften Mäusen ein signifikanter Schutz gegen PbA induzierte Enzephalopathie festgestellt werden. Die immunologische Charakterisierung von Milz Zellpopulation und Serum Zytokinen zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den GPI-CRM197 geimpften Gruppen. Es konnten jedoch Tendenzen beobachtet werden, wobei GPI5 immunisierte Mäuse eine verringerte Zellaktivierung sowie ebenfalls verringerte TNF-α, IFN-γ und IL-6 Spiegel im Serum aufwiesen. Diskussion: In dieser Studie konnte die Wirksamkeit und der Wirkmechanismus eines GPI Glykokonjugat-Impfstoffes weiter untersucht werden. Zum ersten Mal wurden das zugelassene Trägerprotein CRM197 und Alum als Adjuvans verwendet. Es ließ sich eine Struktur Funktionsbeziehung verschiedener synthetischer GPI-Konstrukte in Bezug auf die Immunogenität mittels Glycan Array-Analyse herstellen. Ferner konnte die anti inflammatorische Wirksamkeit antitoxischer GPI-Impfstoffe reproduziert, sowie ein daraus resultierendes verbessertes Überleben in ECM- empfänglichen Mäusen festgestellt werden. Zusammenfassend lässt sich herausstellen, dass der Nachweis eines partiellen Impfschutzes gegen Plasmodium GPI induzierte ECM durch synthetische GPI Vakzine gelungen ist.
