α-Helical coiled coil mimicry by alternating sequences of β- and γ-Amino acids

Abstract

The goal of this work was to develop helical conformations by using synthetic foldamers that could be functionally modulated to selectively disrupt unfavourable helix-helix interactions. Adhering to the principle of “equal backbone atoms”, the alternating βγ sequence appears to be well-suited to mimic an α-helical conformation. As a case study, the backbone modification is applied to a natural helical protein folding motif, the α-helical coiled coil. First an extended sequence of and amino acids was substituted in a coiled coil forming sequence. The helical structure is induced through oligomerization while the individual βγ segment is mostly unstructured. The natural side chains were preserved to more accurately imitating natural packing of αβγ chimera. The self- and hetero-assembly of a series of αβγ-chimeric sequences is investigated in model peptide systems as well as the biologically-derived GCN4pLI sequence by means of a variety of theoretical and experimental methods and assays, such as MD simulations, CD, SEC, AU, TEM, as well as FRET, disulfide exchange and template-directed native chemical ligation assays. The next task was to optimize the interactions between the artificial sequence and the native partner by means of two medium-throughput methods. Spot synthesis/analysis and phage display techniques revealed the key side chain properties that are required for coiled coil assembly. The phage display technique selected α-sequences with primary structures that would not have been considered in a rational design approach, but were observed to be better binding partners for the αβγ-chimera. Further, the function of the artificial folding motif was studied in the context of its catalytic activity in the native chemical ligation. In order to bring the essential functional groups together and present a well-formed catalytic site, αβγ-chimera had to be and were shown to mimic the natural α-helical coiled coil structure. The structural consequences of the ααα→βγ isosteric backbone substitution, such as disruption in local packing or conformational degrees of freedom due to further loss of H-bond are other interesting aspects which were studied in detail. As determined by disulfide exchange assays, the pairing of αβγ- chimeric sequences with the native GCN4pLI sequence is thermodynamically allowed only in the case of an ideal arrangement of β- and γ-residues. This indicates a similarity in the local side chain packing of β- and γ-amino acids at the helical interface of αβγ-chimeras and the native α-peptide. Altogether, the observations are consistent with the theoretical studies and show that the stability of a αβγ-peptide bundle can be tuned by controlling the extent of the side chain interactions at the interhelical recognition domains.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit synthetischen β,γ-Foldameren, die dazu designed worden, die α-helikale Konformation zu imitieren. Im Rahmen der Wirkstoffentwicklung könnte es mit Hilfe derartiger Strukturen ermöglicht werden, Einfluss auf unerwünschte z.B. im Rahmen bestimmter Krankheiten auftretenden Protein-Protein-Interaktionen zu nehmen. Basierend auf dem Prinzip, die Anzahl der Atome im Peptidrückgrat konstant zu halten, sollten alternierende Sequenzen aus β- und γ- Aminosäuren eine der α-helikalen Konformation nahe kommende Struktur einnehmen. Als Modell, um diese Hypothese zu überprüfen, wird im Rahmen dieser Studie das α-helikale Coiled-Coil- Faltungsmotiv verwendet. Hierzu wurde ein Segment einer Coiled-Coil bildenden α-Sequenz durch β- und γ-Aminosäuren ersetzt, um somit ein α,β,γ-Chimär zu generieren. Das Design der α,β,γ-Sequenz wurde dabei so gewählt, dass die natürlichen Seitenketten beibehalten wurden, um dadurch das native Packungsmuster zu gewährleisten. Die Helixbildung in diesem System wird durch Oligomerisierung induziert, während die isolierte β,γ-Sequenz größtenteils unstrukturiert vorliegt. Im Folgenden wurden verschiedene α,β,γ-Chimäre hinsichtlich ihrer Oligomerisierung sowohl an dem Modell als auch im Rahmen einer natürlich vorkommenden Coiled-Coil-Sequenz, GCN4pLI, untersucht. Dabei kam eine von Vielzahl von theoretischen und experimentellen Methoden und Assays wie Molekulardynamic-Simulationen, CD-Spektroskopie, Größenausschluss- Chromatografie, analytische Ultrazentrifugation, Transmissionselektronen- Spektroskopie sowie auch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, Disulfid- Austauschexperimente und „Native Chemische Ligation“ zur Anwendung. Im Anschluss an diese Untersuchungen wurden mit Hilfe zweier Medium-Throughput- Methoden (Spot-Synthese und Phage-Display) optimale Interaktionspartner für die artifizielle α,β,γ-Sequenz identifiziert. Während der rationale Ansatz bei der Spot-Synthese von vorn herein bestimmte Sequenzen ausschloss, schöpfte die Phage-Display-Technik aus dem gesamten Pool codierter Aminosäuren, sodass hiermit dem Wildtyp zwar strukturell wenig ähnelnde jedoch strukturell stabilere Bindungspartner gefunden werden konnten. Die Funktion des künstlichen Faltungsmotivs wurde im Kontext der templat-gesteuerten „Nativen Chemischen Ligation“ untersucht. Um die reaktiven funktionellen Gruppen in räumliche Nähe zu bringen, muss die α,β,γ-Sequenz die natürliche α-helikale Struktur imitieren können. Diese Eigenschaft konnte im Rahmen dieser Untersuchungen bestätigt werden. Weitere Auswirkungen der strukturellen Veränderungen durch den isosteren α,α,α→β,γ-Austausch, wie z.B. Verlust lokaler Packung und Gewinn an konformationeller Flexibilität durch die Eliminierung von Wasserstoffbrücken im Rückgrat wurden ebenfalls untersucht. In Disulfid-Austausch-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Paarung der chimären Sequenz mit der natürlichen GCN4pLI-Sequenz thermodynamisch nur erlaubt ist, wenn die β- und γ-Reste einer bestimmten Sequenz (βγβγ) folgen. Dies weist darauf hin, dass nur in diesem Fall die lokale Packung der Reste dem natürlichen Packungsmuster hinreichend ähnlich ist. Diese Beobachtungen stimmen mit den theoretischen Studien überein und zeigen, dass die Stabilität der Interaktionen mit α,β,γ-chimären Sequenzen durch das Ausmaß an Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten in der helikalen Interaktionsdomäne kontrolliert werden kann.