Untersuchungen zur Diagnostik und Epidemiologie von Staphylococcus aureus in Milchviehbetrieben in Brandenburg

Abstract

Ziel dieses Projekts war es erstens, das epidemiologische Verhalten von Staphylococcus (S.) aureus mittels Genotypisierung und Antibiogrammtypisierung zu untersuchen. Zweitens wurden die auf den untersuchten Betrieben isolierten Staphylokokken Isolate verschiedenen diagnostischen Testverfahren unterzogen, um die Eignung der Tests für die Identifikation von S. aureus aus Milchproben zu prüfen. Es wurden auf sechs Milchviehbetrieben in Brandenburg mit einer hohen Prävalenz intramammärer S. aureus Infektionen von jeweils 32 Kühen verschiedener Laktationsstadien und Altersklassen Viertelgemelksproben genommen. Von jedem Betrieb wurden 20 bzw. 22 S. aureus Isolate mittels Random amplified polymorphic DNA-Polymerase-Chain-Reaction (RAPD-PCR) und Agardiffusionstest typisiert. Die RAPD-PCR wurde mit jeweils 2 Primern durchgeführt. Mittels Agardiffusionstest wurde die Empfindlichkeit jedes Isolats gegenüber 12 Antibiotika bestimmt. Es wurden nur die jeweils auf einem Betrieb gefundenen S. aureus Isolate miteinander verglichen. Auf den einzelnen Betrieben konnten mittels RAPD-PCR zwischen 2 und 6 verschiedene S. aureus Stämme ermittelt werden. In jedem untersuchten Betrieb konnte je ein zahlenmäßig dominierender S. aureus Stamm identifiziert werden. Dieser Stamm machte zwischen 54,5 und 95,5% der untersuchten S. aureus Isolate aus. S. aureus Isolate, die aus Milchproben von Erstkalbinnen isoliert wurden, unterschieden sich nicht von denen, die aus Milchproben multiparer Tiere gewonnen werden konnten. Der in dem jeweiligen Betrieb dominierende Stamm konnte bei Tieren mit unterschiedlichen Laktationsnummern und in unterschiedlichen Laktationsstadien gefunden werden. Die in geringer Zahl vorkommenden Stämme wurden vermehrt aus Milchproben von multiparen Tieren gewonnen. Mittels Antibiogrammtypisierung konnte in drei der sechs Betriebe allen S. aureus Isolaten ein identisches Resistenzprofil zugewiesen werden. In zwei weiteren Betrieben ließen sich die Isolate zwei bzw. drei Resistenzprofilen zuordnen. Nur ein Betrieb wies fünf unterschiedliche Resistenzprofile auf. Es bestand keine Übereinstimmung der Typisierungsergebnisse zwischen RAPD-PCR und Agardiffusionstest. Im zweiten Teil der Untersuchung wurden 269 Staphylokokken Isolate, die auf den sechs untersuchten Betrieben gefunden wurden, verschiedenen diagnostischen Testverfahren unterzogen. Zu diesen Verfahren zählten die Testung des Hämolyseverhaltens, der Röhrchenkoagulasetest, die anaerobe Mannitvergärung, das Wachstum auf acriflavinhaltigem Agar, der Acetoin Test, und zwei im Handel erhältliche Schnellagglutinationstests (Staphylase-Test ® (Oxoid) und Slidex Staph Plus ® (bioMerieux)). Als S. aureus wurden alle Isolate angesehen, die eine positive Koagulasereaktion, eine anaerobe Mannitvergärung und Wachstum auf acriflavinhaltigem Agar zeigten. Aufgrund dieser Untersuchungen konnten 193 (71,7%) Isolate als S. aureus und 72 (26,8%) als Koagulase negative Staphylokokken (KNS) identifiziert werden. Vier Isolate (1,5%) waren Koagulase positiv, konnten aber nicht S. aureus zugeordnet werden. Das Auftreten und die Art der Hämolyse allein konnte nach den Ergebnissen dieser Studie nicht als eindeutiges Kriterium für S. aureus bewertet werden. Als größtes Problem bei der Anwendung im Handel erhältlicher Schnellagglutinationstests stellte sich das Auftreten einer großen Zahl nicht auswertbarer Reaktionen heraus.

The objective of this study was to analyse the epidemiological features of Staphylococcus (S.) aureus by using genotyping and antibiogram typing. Furthermore different methods for identification of S. aureus were performed to compare the methods ability to identify S. aureus from bovine milk. Milk samples were collected from six dairy herds with high prevalence of S. aureus in the federal state of Brandenburg, Germany. Of each herd, 32 cows in different stages of lactation and different age groups were chosen for sampling. Using Random Amplified Polymorphic DNA Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) and disk diffusion assay between 20 and 22 S. aureus isolates were typed per herd. RAPD-PCR was performed using two different primers. A panel of 12 antibiotics was used in the disk diffusion assay. The fingerprints of the S. aureus strains were compared within herds, not between herds to analyse the distribution of strains within herds. Using RAPD-PCR the number of S. aureus strains found in each herd varied between two and six. In each herd one of the strains could be identified as numerically dominating. This strain accounted for 54,5% to 95,5% of the analysed isolates. S. aureus strains obtained from milk samples of primiparous cows did not differ from S. aureus strains obtained from milk samples of multiparous cows. The dominant strain of a particular dairy herd was found in cows of different stages of lactation and different age groups. The numerically marginal strains (only one or two isolates) were mainly found in milk samples of multiparous cows. Using antibiogram typing in three of the six dairy herds all S. aureus isolates were categorized as identical in terms of resistance features. In two more dairy herds the S. aureus isolates were categorized in 2 and 3 groups with identical resistance features, respectively. Only one dairy herd showed five different groups in terms of resistance features. There was no conformity in the results of the applied typing methods RAPD-PCR and diffusion disc method. The diagnostic methods applied were hemolysis, tube coagulase testing, anaerobic fermentation of mannitol, growth on agar supplemented with acriflavin, production of acetoin and two commercially available latex agglutination tests (Staphylase-Test ® (Oxoid) and Slidex Staph Plus ® (bioMerieux)). The testing panel consisted of 269 staphylococcus isolates. A particular isolate was categorized as S. aureus, provided that all of the following conditions were met: it showed a positive tube coagulase test, anaerobic fermentation of mannitol and growth on agar supplemented with acriflavin. Applying these conditions 193 (71,7%) of all isolates were identified as S. aureus, whereas 72 (26,8%) were identified as coagulase negative staphylococci (CNS). Four isolates (1,5%) showed positive tube coagulase test but could not be identified as S. aureus. The sole occurrence and the type of haemolysis was no sufficient criterion in this study to identify an isolate as S. aureus. The main problem of the application of the two rapid identification kits proved to be the occurrence of non-classifiable results.