Das Equine Herpesvirus Typ 2 (EHV-2): Studien zur Prävalenz in Augentupfern und zum Gewebe- und Zelltropismus, insbesondere in Bezug auf die equine Keratokonjunktivitis

Abstract

Die hier vorliegende Arbeit dient der weiteren Erforschung der ätiopathogenetischen Bedeutung von EHV-2. Die Untersuchungsschwerpunkte lagen hierbei auf der klinischen Relevanz bei der Entstehung von Konjunktivitiden und Keratitiden, dem Gewebetropismus und möglichen Latenzorten von EHV-2 bei Equiden. Dabei wurden für eine klinische Vergleichsstudie von 28 augenkranken und 28 gesunden Tieren zweimal im Abstand von 4-5 Wochen Blut- und Tupferproben in der Pferdeklinik der TiHoHa entnommen und im Institut für Virologie des Fachbereichs Veterinärmedizin der FU-Berlin auf EHV-2 untersucht. Ferner wurde versucht, EHV-2 in unterschiedlichen post-mortem- Geweben von 20 Pferden nachzuweisen. Alle untersuchten Proben stammten von natürlich infizierten Tieren. In der klinischen Vergleichsuntersuchung konnte EHV-2 sowohl bei Test- als auch bei Kontrolltieren mittels serologischer Methoden, nPCR und Kokultivierung detektiert werden. Es zeigte sich bei keiner der verwendeten Methoden ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen EHV-2 Nachweis und den Merkmalen augenkrank und gesund. Bemerkenswert ist, daß der EHV-2-Nachweis mit allen obengenannten Methoden bei Maultieren gelang, die somit für EHV-2 permissiv zu sein scheinen. Die Beprobung der Augen erfolgte aus dem Konjunktivalsack und wurde parallel mit Wattetupfern und Cytobrushes durchgeführt, wobei der EHV-2-Nachweis in beiden Gruppen statistisch signifikant häufiger in Cytobrush- als in Wattetupferproben gelang. Da mittels Cytobrush mehr Zellen bei der Beprobung entnommen wurden, könnte der häufigere Nachweis von EHV-2 in Cytobrush- als in Wattetupferproben ein Indiz sein, daß EHV-2 in den tieferen Schichten der Konjunktiva intrazellulär und damit unter Umständen latent vorliegt. Die Tatsache, daß der EHV-2-Nachweis bei den untersuchten Blut- und Tupferproben am häufigsten in den Cytobrushproben geführt wurde und somit sogar öfter in dem Konjunktivalsack als in den als Latenzort für EHV-2 beschriebenen PBMC gelang, könnte ebenfalls auf die Konjunktiva als Latenzort von EHV-2 hindeuten. In den post-mortem-Geweben gelang die Detektion von EHV-2 mittels nPCR öfter in Schleimhäuten (56% der Konjunktivae, 2/2 Nasenschleimhäute) als in Tränendrüsen (31%), Lungen (24%), Nervengeweben (20% der Trigeminalganglien, 10% der Sehnerven) oder im Kammerwasser (0%). Folglich wurde EHV-2 auch in den untersuchten post-mortem- Geweben am häufigsten in der Konjunktiva nachgewiesen. Ferner wurde EHV-2 in Tränendrüse, Nasenschleimhaut und Sehnerv stets nur auf der Seite nachgewiesen, die auch eine positive Konjunktiva aufwies. Dies könnte darauf hindeuten, daß es sich bei der Konjunktiva um eine Eintrittspforte für EHV-2 handelt, von der aus sich das Virus in die benachbarten Gewebe ausbreitet. Daß bei 75% der Tiere mit EHV-2-positiven Nasentupferproben auch im Auge EHV-2 nachgewiesen werden konnte, spricht ebenfalls für eine Ausbreitung des Virus über den Tränennasenkanal. In den Trigeminalganglien eines natürlich intrauterin-infizierten und im achten Trächtigkeitsmonat abortierten Fötus konnte EHV-2 beiderseits nachgewiesen werden. Es wurden genetisch divergierende EHV-2-Stämme sowohl zum selben Untersuchungszeitpunkt in Tupfer- und Blutproben eines Pferdes als auch zu unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten in Augen- bzw. Nasentupfern bzw. Blutproben bei ein und demselben Tier nachgewiesen. Mit den in dieser Arbeit verwendeten Primern und Restriktionsenzymen ließen sich allerdings keine genetischen Gemeinsamkeiten erkennen, die Rückschlüsse auf Virulenz oder Gewebetropismus der verschiedenen EHV-2-Stämme zuließen.

The aim of this project was to further investigate the etiopathogenetic role of EHV-2. The main goal was to exam the clinical relevance of EHV-2 in the genesis of conjunctivitis and keratitis, tissue tropism and possible sites of latency in horses. Blood samples and swabs from 28 eye diseased test group animals and 28 healthy control group horses were taken twice within 4-5 weeks in the horse clinic of the Tierärztliche Hochschule Hanover. These samples were virologically investigated in the Institute of Virology, Faculty of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin. Furthermore, post-mortem tissues from 20 naturally infected horses were analysed for EHV-2. EHV-2 was detected by various serological methods, nested PCR (nPCR) and co-cultivation in both the test and control group. A statistically significant correlation between infection and tested groups was not observed. Interestingly, EHV-2 was detected in mules using the aforementioned methods, implicating that mules appear to be permissive for EHV-2. The sampling of the eye was carried out in parallel with cotton wool swaps and Cytobrushes from the conjunctival fossa. In both groups EHV-2 was detected significantly more often in the samples obtained by the Cytobrush. As a Cytobrush sample contains much more cell material than a cotton wool swab sample, it is likely that the higher frequency of EHV-2 detection in Cytobrush samples indicates an intracellular virus load of the deeper stratums of the conjunctiva. Therefore, the conjunctiva might be a site of latency of EHV-2. The fact that EHV-2 was detected more frequently in Cytobrush samples from the conjunctival fossa than in PBMC, an already known site of latency, provides further evidence that the conjunctiva may be a site of latency. In post-mortem tissues, EHV-2 was found more often in mucous membrane (56% of the conjunctiva, 2/2 noses) than in the lachrymal glands (31%), the lung (24%), nerve tissue (20% of the trigeminal ganglia, 10% of the optic nerves) and the aqueous fluid (0%) via nPCR. These results demonstrate that EHV-2 was detected most frequently in the conjunctiva of post-mortem tissues. In tissues analysed from the lachrymal gland, nose and optic nerve, EHV-2 was present only in conjunction with areas which were observed to have an EHV-2-positive conjunctiva. This suggests that the conjunctiva might act as a portal for EHV-2, and that the virus spreads from the conjunctiva to other tissues. Another indicator for virus spread via the lacrimal-nose-channel was indicated by the fact that 75% of horses with EHV-2-positive nose swabs were also positive for EHV-2 in the eye swab sample. EHV-2 was detected in a naturally-intrauterine-infected foetus, which was aborted during the eighth month of pregnancy. EHV-2 was detected in the trigeminal ganglia of this foetus. Genetically differing EHV-2 serovars were present in both swabs and in blood samples taken from the same horse simultaneously as well as in eye- and nose- and blood-samples taken from one animal at various time points. No genetic similarities were observed by using the described primers and restriction enzymes. Thus no conclusions concerning the virulence and tissue tropism of different EHV-2 serovars were revealed.