Vergleich unmittelbarer versus verzögerter Transplantation autologer, mesenchymaler Stammzellen nach schwerem Muskeltrauma der Ratte

Abstract

Durch Unfälle, sportliche Aktivitäten oder chirurgische Eingriffe verursachte Muskelverletzungen stellen eine ernstzunehmende Problematik im klinischen Alltag aller Fachrichtungen dar und schränken Patienten oft lebenslang ein. Obwohl die Skelettmuskulatur über gute in-trinsische Regenerationsfähigkeiten verfügt, kommt es posttraumatisch oft zu einem Funktionsdefizit der Muskulatur. Die Ursachen hierfür können sowohl in einem insuffizienten Wiederaufbau von funktionellem Muskelgewebe als auch in einer überschießenden Fibrosierung innerhalb des verletzten Muskels gesucht werden. Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten beschränken sich auf Ruhigstellung, Kühlung, Kompression und Hochlagerung der Muskulatur. Für weitere Therapieansätze, wie bspw. der Applikation von nicht-steroidalen, anti-inflammatorischen Medikamenten konnten bisher nur unbefriedigende Ergebnisse beobachtet werden. Ein aktuell diskutierter und untersuchter Gegenstand ist die potenzielle Nutzung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in klinischen Fragestellungen. Hierzu wurden verschiedene vielversprechende Beobachtungen in unterschiedlichen Fachbereichen wie der Kardiologie oder der Neurologie publiziert. In Vorarbeiten konnte sowohl der positive Effekt einer lokalen Transplantation von MSCs auf die funktionelle Muskelregeneration nach einem Trauma als auch die Abhängigkeit der funktionellen Regeneration von der Menge der transplantierten MSCs nachgewiesen werden. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ergibt sich aus der Untersuchung des Einflusses verschiedener Transplantationszeitpunkte von autologen MSCs in einen verletzten Muskel auf dessen funktionelle Muskelregeneration. Die primäre Hypothese der Dissertation besagt, dass eine direkt auf das Muskeltrauma folgende Transplantation von MSCs einer verzögerten Transplantation in Bezug auf die Muskelregeneration unterlegen ist. Weiterhin wurde davon ausgegangen, dass sowohl eine sofortige als auch eine verspätete Transplantation von MSCs einen positiven Einfluss auf die Muskelregeneration hat. Für den Versuch wurden 27 weibliche Sprague-Dawley Ratten in drei Gruppen (n=9) aufgeteilt. Die Zellgewinnung erfolgte aus dem tibialen Knochenmark. Zwei Wochen auf die Zellentnahme folgend wurde den Versuchstieren ein standardisiertes, stumpfes Trauma des Musculus soleus zugefügt. Es wurde eine unmittelbar auf das Trauma folgende Transplantation mit einer um eine Woche versetzten Transplantation verglichen. Beide Gruppen erhielten jeweils 2 x 106 MSCs in den verletzten Muskel injiziert, zum Zeitpunkt der Transplantation der Vergleichsgruppe wurde physiologische Kochsalzlösung verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde zu beiden Zeitpunkten physiologische Kochsalzlösung injiziert. Vier Wochen nach dem Trauma wurde die Kraft der tetanischen sowie der fast-twitch (FT)-Kontraktionen des M. soleus in vivo durch beidseitige Stimulation des Nervus ischiadicus gemessen. Weiterhin wurden die Zellen auf ihre Adhäsions- sowie auf ihre Differenzierungsfähigkeit untersucht. Messungen ergaben einen Verlust der ursprünglichen Kontraktionskraft von 62 % bei tetanischer und 43,5 % bei FT-Kontraktion durch die Traumatisierung. Durch lokale Injektion von MSCs konnte am M. soleus unabhängig vom Transplantationszeitpunkt im Vergleich zur Kontrollgruppe eine relative Steigerung der tetanischen Kraft um 51,5 % und von 66,5 % der Kraft bei FT-Kontraktionen beobachtet werden. Tetanische und FT-Kontraktionskräfte waren nach Transplantation von MSCs im Vergleich zu nicht-transplantierten Tieren signifikant (p<0,05) größer. Im Gegensatz zur Hypothese konnte bei Vergleich der sofortigen mit der verspäteten Transplantation weder für tetanische Kontraktionen (p=0,73) noch für FT- Kontraktionen (p=0,93) ein signifikanter Unterschied der Kontraktionskräfte festgestellt werden. Der Vergleich der verschiedenen Transplantationszeitpunkte zur Kontrollgruppe ergab einen signifikant geringeren Kraftverlust (p<0,05) sowohl bei FT als auch bei tetanischen Kontraktionen für die verspätete Transplantation. Die sofortige Transplantation konnte eine signifikante Verbesserung (p<0,05) der Kontraktionskraft bei FT-Kontraktionen erreichen, bei tetanischen Kontraktionen war eine Tendenz zu einer Verbesserung zu beobachten. Es zeigte sich kein signifikanter Einfluss (p=0,85) einer Zelltransplantation auf die Twitch / Tetanus Ratio der Muskulatur. Jedoch konnte eine signifikante Verschiebung (p<0,005) der Ratio bedingt durch die Traumatisierung unabhängig von Zugehörigkeit zu den unterschiedlichen Transplantationsgruppen beobachtet werden. Durch diese Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine sofortige wie auch die verspätete Transplantation von autologen MSCs in Bezug auf ihren Einfluss auf die funktionelle Muskelregeneration nach einem Trauma gleichwertig sind, jedoch sowohl eine sofortige wie auch eine verspätete Transplantation autologer MSCs einen Vorteil für die Muskelregeneration erbringen kann.

Skeletal muscle trauma, often caused by accidents, sportive activities or surgical procedures, can pose challenging problems in every clinical field and can result in a lifelong restriction for the patient. Although skeletal muscles have good intrinsic capacities for regeneration, a trauma often results in posttraumatic, functional deficits. Reasons for this can be attributed to an inadequate reconstruction of contractive, functional muscle tissue as well as to an intramuscular fibrosis caused by an excessive inflammatory reaction. Other treatment options are limited to resting, cooling, compression and elevation of the affected muscle. Further therapeutic means such as the application of non-steroid, anti-inflammatory drugs have shown unsatisfactory results so far. The potential use of mesenchymal stem cells (MSCs) in clinical settings is much discussed and therefore subject of scientific studies. Promising observations on this matter have been published in different clinical fields such as cardiology and neurology. In previous studies we could show a positive effect of a local transplantation of MSCs on the functional muscle regeneration and further demonstrated a dose-response relationship of MSC-transplantation after severe skeletal muscle trauma in rats. The aims of the present work were to examine the influences on the functional muscle recovery for different time points of the transplantation of autologous MSCs after a severe muscle trauma. It was hypothesized that an immediate transplantation of MSCs following a trauma is inferior to a delayed transplantation of MSCs concerning the functional muscle regeneration. Furthermore, it was expected that both the immediate and delayed transplantation of MSCs will show a positive outcome regarding the muscle regeneration. In the experiment, 27 female Sprague-Dawley rats were divided into three groups (n=9). Bone marrow aspirations were taken from both tibiae of each animal. A standardized, blunt crush injury was performed on the animals left soleus muscle two weeks following the bone marrow aspirations. The immediate posttraumatic transplantation of MSCs was compared to transplantation one week later. Both groups were injected with 2 x 106 MSCs into the traumatized muscle, using a sham injection of saline solution at the point of time the comparison group was transplanted respectively. The control group was treated with a sham injection of saline solution at both points of time. The force after both tetanic and fast-twitch (FT) stimulation was measured in vivo four weeks following skeletal muscle injury by stimulation of the sciatic nerve on both sides. In a separate experiment, the cells were examined for surface adhesion and their ability to differentiate into osteogenic and adipogenic lineages. The traumatized muscles showed a reduction of 62 % of their original tetanic contraction forces and of 43,5 % of their FT contraction forces caused by the trauma. Local injection of MSCs into the soleus muscle lead to a relative increase of 51,5 % of tetanic forces and of 66,5 % of FT forces compared to the sham-treated control group independent of the point of time of the transplantation. Tetanic and FT contraction forces were significantly (p<0,05) higher in animals after transplantation of MSCs compared with non-transplanted animals. Surprisingly, the comparison of immediate with delayed transplantation did not result in a significant difference in contraction forces neither for tetanic (p=0,73) nor for FT stimulations (p=0,93). The comparison of the different transplantation groups with the sham-treated control group showed a significantly lower loss of force (p<0,05) in tetanic and FT contractions for the delayed transplantation group of MSCs. Moreover, the immediate transplantation of MSCs could show a significant improvement (p<0,05) to its contraction force at FT stimulation and the tendency of improvement for tetanic stimulations. No significant changes (p=0,85) to the Twitch / Tetanus ratio could be observed after the transplantation of MSCs. However, a significant shift (p<0,005) of the ratio was caused by the injury to the muscle, regardless of the experimental groups the animals belonged to. This work proves for the first time, that an immediate as well as a delayed transplantation of autologous MSCs are equal in regard to their influences on the functional muscle regeneration. Yet it was shown that regarding the functional muscle regeneration, both immediate and delayed transplantation of autologous MSCs leads to a functional benefit.