Effect of surfactants on the therapeutic efficacy of atovaquone nanosuspensions against acute and reactivated murine toxoplasmosis

Abstract

Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that is distributed worldwide. The seroprevalence in humans reaches up to 70% in Germany and France. Toxoplasmic encephalitis (TE) is the most common clinical manifestation of reactivated disease in immunocompromised patients that is lethal if untreated. Acute primary standard therapy for the treatment of TE is the combination of pyrimethamine plus sulfadiazine or clindamycin, but these combinations are associated with hematological toxicity and/or life threatening allergic reactions in 5 to 15% of patients. Therefore alternative treatment options are needed. Atovaquone, a hydroxy-1,4-naphthoquinone drug is safe and shows high efficacy against T. gondii in-vitro. However, in-vivo studies have shown less convincing results. Since the bioavailability of the present oral suspension (Wellvone®) is very poor and little is known about the uptake into the brain, modified formulations of atovaquone may be promising for the therapy of TE. Therefore, in the present thesis project, atovaquone nanosuspensions (ANSs) were synthesized and coated with different surfactants to enhance the oral bioavailability and passage through the blood brain barrier (BBB). First, using an in-vitro model of the intestinal barrier I investigated the passage of ANSs compared to the commercial Wellvone® suspension. Coating of ANSs with polysorbate 80 (Tween® 80) and poloxamer 188 (P188) as surfactants showed significantly enhanced transport across the intestinal barrier in comparison to sodium dodecyl sulfate (SDS)-coated ANSs and Wellvone® suspension. Next, the passage of ANSs compared to Wellvone® suspension across the BBB was investigated using an in-vitro co-culture transwell model. I observed that ANSs coated with P188 showed significantly enhanced transport in comparison to Wellvone® suspension. Finally, to prove whether ANSs show increased bioavailability, increased uptake into the brain, and superior therapeutic efficacy compared to Wellvone® in the treatment of TE in-vivo I used mouse models of acute and reactivated toxoplasmosis. Concentrations of ANSs coated with SDS were significantly higher in the serum and brains of mice compared to Wellvone® suspension. Furthermore, parasite loads in brains determined by quantitative PCR and immunohistochemistry as well as numbers of inflammatory foci in brains of mice treated with SDS-coated ANSs were reduced compared to untreated controls and to Wellvone®-treated mice In summary, whereas ANSs coated with Tween® 80 and P188 showed enhanced transport of atovaquone across the intestinal barrier in-vitro, ANS coated with P188 enhanced transport of atovaquone through the BBB compared to Wellvone® in-vitro. However, in-vivo, ANS coated with SDS enhanced bioavailability and brain uptake of atovaquone and thereby improved the therapeutic efficacy of atovaquone in mice infected with T. gondii. In conclusion, modification of surface properties of ANSs markedly alters the capacity of drugs to cross host barriers. In-vitro models of host barriers do not appear to appropriately reflect the in-vivo situation. Only ANS coated with SDS improved the therapeutic efficacy of atovaquone for the treatment of TE. These results presented in this thesis project will help to establish innovative, safe and efficacious strategies for the treatment of TE in humans.

Toxoplasma gondii ist ein weltweit verbreiteter, intrazellulärer Parasit. Die Seroprävalenz beim Menschen liegt in Deutschland und Frankreich bei bis zu 70%. Eine Toxoplasma-Enzephalitis (TE) gehört somit zu den häufigsten klinischen Erscheinungsformen der reaktivierten Toxoplasmose. Diese Erkrankung verläuft bei immunsupprimierten Patienten ohne entsprechende Behandlung häufig tödlich. Die primäre Standardtherapie bei einer akuten TE besteht aus einer Kombination von Pyrimethamin und Sulfadiazin bzw. Clindamycin. Jedoch gehen diese Kombinationen bei 5 bis 15% der behandelten Patienten häufig mit hämatologischer Toxizität und/oder lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen einher. Aus diesem Grund besteht ein dringender Bedarf an alternativen Therapieoptionen. Atovaquon, ein Hydroxy-1,4-Naphtoquinon-Derivat, besitzt nur geringe Nebenwirkungen und ist in in-vitro-Versuchen zugleich hocheffektiv gegen T. gondii. Bisherige in-vivo-Studien konnten jedoch nur wenig überzeugende Ergebnisse aufweisen. Da die Bioverfügbarkeit der oralen Suspension (Wellvone®) sehr gering und nur wenig über deren Aufnahme in das Gehirn bekannt ist, könnten modifizierte Atovaquon-Formulierungen ein vielversprechender Ansatz bei der Behandlung von TE sein. In Anbetracht dieser Situation wurden für die vorliegende Doktorarbeit Atovaquon-Nanosupensionen (ANSs) synthetisiert und mit verschiedenen Tensiden beschichtet. Somit sollte eine verbesserte orale Bioverfügbarkeit und eine verstärkte Passage von Atovaquon über die Blut-Hirn-Schranke gewährleistet werden. Zuerst habe ich unter Zuhilfenahme eines in-vitro-Modells der intestinalen Barriere die Passage von ANSs im Vergleich zur kommerziell erhältlichen Wellvone®-Suspension untersucht. Die Beschichtung der ANSs mit den Tensiden Polysorbat 80 (Tween® 80) sowie Poloxamer 188 (P188) bewirkte im Vergleich zu den mit SDS beschichteten ANSs oder Wellvone® einen signifikant höheren Atovaquon-Transport über die intestinale Barriere. Im Anschluss daran wurde in einem in-vitro-Modell der Blut-Hirn-Schranke die Passage von ANSs im Vergleich zu Wellvone® untersucht. Ich konnte dabei feststellen, dass die mit P188 beschichteten ANSs einen im Vergleich zur Wellvone®-Suspension signifikant erhöhten Atovaquon-Transport aufwiesen. Um nachzuweisen, dass ANSs die Bioverfügbarkeit von Atovaquon tatsächlich erhöhen, die Aufnahme von Atovaquon in das Gehirn verbessern und eine Optimierung der therapeutischen Effizienz gegenüber der Wellvone®-Suspension zeigen, kamen in in-vivo-Ansätzen Mausmodelle für die akute und die reaktivierte Toxoplasmose zum Einsatz. Die Konzentrationen der mit SDS beschichteten ANSs in Serum und Gehirn der Mäuse waren signifikant größer als die der Wellvone®-Suspension. Des Weiteren konnten im Gehirn von Mäusen, die mit SDS beschichteten ANSs behandelt worden waren, mittels quantitativer PCR, immunhistochemischer Untersuchungen sowie durch die Bestimmung inflammatorischer Areale deutlich weniger Parasiten nachgewiesen werden als bei unbehandelten Kontrollen oder bei den mit Wellvone® behandelten Mäusen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die mit Tween® 80 oder P188 beschichteten ANSs bei in-vitro-Versuchen einen höheren Atovaquon-Transport induzierten, als dies im Vergleich zur Wellvone®-Suspension der Fall war. Bei in-vitro-Versuchen mit einem Blut-Hirn- Schranken-Modell zeigten ebenfalls die mit P188 beschichteten ANSs einen besseren Atovaquon-Transport als die Wellvone®-Suspension. Bei den durchgeführten in-vivo-Versuchen stellte sich jedoch heraus, dass ANSs, die mit SDS beschichtet worden waren, die Bioverfügbarkeit sowie die Aufnahme von Atovaquon in das Gehirn erhöhten und somit die therapeutische Effizienz von Atovaquon bei T. gondii-infizierten Mäusen verbesserten. Als Schlussfolgerung kann also festgestellt werden, dass die Modifikation von Oberflächeneigenschaften bei ANSs deren Fähigkeit zur Barrierepassage im Wirt eindeutig verändert. In-vitro-Modelle von Wirtsbarrieren reflektieren die in- vivo-Situation allerdings nur unzureichend. Lediglich die mit SDS beschichteten ANSs verbesserten die therapeutische Effizienz von Atovaquone im Rahmen einer TE-Behandlung. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse werden dazu beitragen, innovative, sichere und effiziente Behandlungsstrategien gegen TE beim Menschen zu entwickeln.