Molekulare Studien über zirkulierende Tumorzellen und zellfreie Nukleinsäuren in präklinischen Modellen und Patientenproben

Abstract

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs), zellfreie Nukleinsäuren (cfDNA) oder tumorspezifische DNA-Moleküle (ctDNA) können entscheidende Informationen für die Diagnostik, die Therapieüberwachung und die Prognoseeinschätzung von Krebspatienten liefern. Die tumorspezifischen Biomarker (CTCs und ctDNA) können zudem als „flüssige Biopsie“ eine Alternative zur herkömmlichen Charakterisierung von Tumorzellen aus Gewebeproben sein und ermöglichen demzufolge auch molekularbiologische Untersuchungen von „nicht-biopsierbaren“ Patienten, wodurch individuelle Therapiestrategien gewählt werden können. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Verfahren für den CTC-Nachweis im Blut von präklinischen Xenograftmodellen miteinander verglichen. Es kann gezeigt werden, dass mobile und metastasierte Tumorzellen Prozesse durchlaufen, die den Verlust von epithelialen Markern wie z.B. EpCAM oder MUC-1 beinhalten, weshalb ein CTC-Nachweis über epitheliale Oberflächenmoleküle im Vergleich zu antigenunabhängigen Methoden in vivo erfolglos bleibt. Darüber hinaus kann in Übereinstimmung zur klinischen Situation die Induzierung von mesenchymalen Markern wie EGFR oder Twist auf CTCs gezeigt werden. Da im klinischen Alltag zahlreiche Verfahren zum Nachweis der CTCs auf dem Prinzip der „epithelialen Selektion“ basieren, müssen demzufolge neue Strategien entwickelt werden, die zusätzlich auch mesenchymale CTC-Populationen im Blut der Patienten detektieren können. Die Wirkung von Arzneistoffen kann über qualitative CTC-Messungen im Tiermodell nicht verfolgt werden. Allerdings kann der Erfolg einer Therapie über die molekulare Analyse der tumorspezifischen DNA-Moleküle im Plasma der Xenografts gemessen werden. Über die Bestimmung der humanen, zellfreien Nukleinsäuren lassen sich DNA- Moleküle im Plasma der Tiere nachweisen, die die Progression des Tumors molekular abbilden, wobei kein Unterschied zwischen subkutanen und orthotopen Modellen zu erkennen ist. Signifikant erhöhte Konzentrationen an zellfreien Nukleinsäuren können zudem auch im Plasma von Krebspatienten im Vergleich zu Proben von gesunden Individuen nachgewiesen werden. Plasmaproben der Kolonkrebskohorte zeigen überdies eine Korrelation zwischen der cfDNA-Menge und dem Metastasestatus, was die Bedeutung der cfDNA-Quantifizierung in Humanproben demonstriert.

Circulating tumor cells (CTCs), circulating cell-free DNA (cfDNA), or tumor- specific cell-free DNA-molecules (ctDNA) have been suggested as cancer biomarkers. These biomarkers might give useful information as diagnostic, prognostic, and monitoring markers in cancer patients. In addition, tumorspecific CTCs or ctDNA-molecules may be used as “liquid biopsy” for molecular targeted agents, enabling the identification of patients who will most likely respond to a given treatment. In this work the performance of different protocols for CTC detection were established (ex vivo) and used for blood sample analysis of murine breast cancer xenograft models (in vivo). It was possible to show that tumor cells which detached from the primary tumor undergo molecular processes in vivo. These modifications include the down regulation of epithelial markers, like EpCAM or MUC-1. The use of EpCAM-based enrichment techniques lead to the loss of CTC populations having undergone EMT. However, the presence of CTCs could be demonstrated by antibody- independent detection methods. Moreover, in accordance to the clinical situation, it could be shown that CTCs up regulate mesenchymal markers, like EGFR or Twist while circulating through the bloodstream. As numerous techniques for CTC detection in clinical practice are based on epithelial markers, new strategies have to be developed which have to detect mesenchymal- like CTC populations, as well. Further, qualitative measurement of CTCs does not reflect efficacy of the therapy in animal models of breast cancer. However, success of therapy can be monitored targeting tumorspecific cell-free DNA-molecules in plasma samples gained from the used xenografts. This approach was successfully used for subcutaneous or orthotopic models.In addition, significantly increased concentrations of cell-free nucleic acids could be detected in plasma of cancer patients compared to healthy individuals. Plasma samples of colorectal cancer patients also indicated a correlation between the quantity and the appearance of metastasis, demonstrating the potential relevance of cfDNA in human samples for the use in the clinical setting.