Polyphenolinduzierte Modulation der Makrophagenabwehr gegenüber Leishmanien

Abstract

Von den zahlreichen Naturstoffen mit antileishmanieller Wirkung zeigten verschiedene Polyphenole Aktivität gegen das intrazelluläre Stadium von Leishmania major und L. donovani ohne nennenswerte Toxizität gegenüber den extrazellulären Promastigoten und den Wirtszellen. Dieser indirekte antileishmanielle Effekt konnte am besten durch Immunmodulation und Induktion antimikrobieller Prozesse in Makrophagen erklärt werden. Getestet wurden einfache Phenole, B-Typ-Proanthocyanidine, hydrolysierbare Gerbstoffe, galloylierte Flavonoidglycoside und Kaffeesäureester. Im großen und ganzen konnte eine antileishmanielle Aktivität und geringe Toxizität für zahlreiche Vertreter dieser Stoffgruppe bestätigt werden, insbesondere hydrolysierbare Gerbstoffe wie Corilagin und Geraniin fielen durch sehr niedrige IC50-Werte gegenüber intrazellulären Stadien auf. All diese Substanzen aktivierten RAW- Zellen zur Sekretion von TNF-alpha und IL-6, einige induzierten auch Interferonaktivität, die durch ELISA auf IFN-alpha zurückgeführt werden konnte. In allen Experimenten dienten IFN-gamma und LPS als Positivkontrolle. Im Gegensatz zu diesem sehr starken und unselektiven Stimulans erwies sich die polyphenolinduzierte Wirtszellaktivität abhängig von experimentellen Details. Zum Beispiel ließen sich nur ruhende Zellen aktivieren, wogegen Polyphenole voraktivierte Zellen eher noch hemmten. Auch ließen sich durch Polyphenole immunologisch bedeutende Parameter wie die Sekretion von TNF und IL-6 nur in infizierten Zellen stark induzieren. Mittels RT-PCR wurde die Makrophagenantwort auf verschiedene Polyphenole auch auf der Transkriptionsebene untersucht. Wiederum waren nur parasitierte Zellen empfänglich für die aktivierende Potenz, was die Ergebnisse aus den Zytokinbestimmungen unterstützte. Das Genexpressionsmuster war weitestgehend identisch mit dem durch IFN-gamma und LPS induzierten. Beispielhaft wurde die IL-12-Sekretion mittels ELISA bestimmt. Während sich IFN-gamma und LPS stets als starke IL-12-Induktoren zeigten, aktivierten Polyphenole nur parasitierte Zellen zur IL-12-Sekretion, am stärksten Corilagin, EGCG und das Proanthocyanidin-Hexamer. Zusammenfassend unterstützen diese Befunde die Hypothese, dass der antileishmanielle Effekt von Polyphenolen auf der Aktivierung antimikrobieller Abwehrmechanismen in der parasitierten Wirtszelle beruht.

Screening a variety of natural compounds and derivatives had revealed appreciable antileishmanial activity for numerous polyphenols. These drugs inhibited the intracellular survival of Leishmania major and L. donovani parasites, while being largely ineffective against their extracellular promastigote form. Toxicity for the experimental host cells was minimal. This indirect antileishmanial effect could best be explained by an immunomodulatory activity of the polyphenols inducing antimicrobial processes in macrophages. The tested compounds included simple phenols, B-type proanthocyanidines, and hydrolyzable tannins as well as galloylated flavonoid glycosides and caffeic acid esters. In general, the appreciable antileishmanial activity and low general toxicity of selected polyphenols could be confirmed. Especially hydrolyzable tannins such as corilagin and geraniin exhibited very low IC50-values with intracellular Leishmania parasites. All these drugs also activated macrophages for the release of tumor necrosis factor (TNF)-alpha and interleukin (IL)-6. Gallic acid, the hydrolyzable tannins, the galloylated flavonoid glycosides, and to a minor extent also some of the caffeic acid esters additionally induced interferon activity which could be attributed, by ELISA technique, to IFN-alpha. In all experiments, IFN-gamma plus bacterial lipopolysaccharide (LPS) was used as a positive control. In contrast to this highly reliable and robust control, host cell activation with polyphenols depended on experimental details. Tested polyphenols activated only resting cells. Addition of polyphenols to IFN or LPS failed to enhance activation but rather reduced NO-release and intracellular Leishmania kill compared to either stimulus alone. This effect was largely independent of the sequence and interval in which these products were added. Employing the RT-PCR technique, macrophage response to selected polyphenols was also investigated at the level of cytokine gene-expression. Again, only parasitized cells were susceptible to polyphenol activation, which strongly supported the results at protein secretion level. With the exception of IFN-gamma, this cytokine gene expression pattern was identical with that induced by IFN-gamma and LPS. Induction of IL-12 was also monitored by ELISA at the protein level. While IFN-gamma and LPS induced release of IL-12 irrespective of their infection status, only Leishmania-infected cells released IL-12 upon stimulation with tested polyphenols. In line with the gene expression data, IL-12 titers were highest in cultures treated with corilagin, EGCG, and proanthocyanidine hexamer. Taken together, these findings strongly support the hypothesis, that antileishmanial effects of polyphenols result from activation of antimicrobial mechanisms in the host cell.