Neuroprotektive Wirkmechanismen von Ceftriaxon: Rolle der Astrozyten-Neuronen-Achse

Abstract

Einleitung: Seit Jahrzehnten wird nach einer Verbesserung der Schlaganfalltherapie gesucht. Aus neuen Erkenntnissen über die Astrozyten- Neuronen-Interaktion haben sich hierbei neue Ansatzpunkte ergeben. Astrozyten können Glutamat über spezifische Transporter (GLT-1) aus dem Extrazellulärraum aufnehmen, verstoffwechseln und dadurch vermutlich Neuronen vor einer Exposition mit hohen Konzentrationen des toxischen Glutamats schützen. Sie spielen somit eine Schlüsselrolle im Rahmen der mit einem Schlaganfall assoziierten Exzitotoxizität. Aus der Literatur ist bekannt, dass das ß -Laktam-Antibiotikum Ceftriaxon in verschiedenen Modellen neurologischer Erkrankungen durch eine Steigerung der Expression oder Aktivität von GLT-1 neuroprotektiv wirkt. Unsere Arbeitsgruppe konnte im Schlaganfallmodell der Ratte zeigen, dass die Behandlung mit Ceftriaxon zu einer Reduktion der 24 -Stunden-Mortalität durch eine Verkleinerung der Infarktgröße und eine Erhöhung der Anzahl überlebender Neuronen innerhalb der Penumbra führt. Die vorgelegte Dissertation hatte zum Ziel, die neuroprotektiven Mechanismen, die durch eine Vorbehandlung mit Ceftriaxon im Rahmen einer Ischämie in den Astrozyten hervorgerufen werden, zu analysieren. Methoden: Primäre Astrozyten wurden aus den Gehirnen neugeborener Ratten isoliert. Die Zellen wurden für 24, 12 und 6 Stunden mit Ceftriaxon vorbehandelt. Anschließend erfolgte eine Applikation von Glutamat und Ceftriaxon für weitere 12 Stunden. Mit Hilfe der Quantitativen Real-time PCR (qRT-PCR) wurde die Genexpression von inflammatorischen Zytokinen, Neurotrophinen und Apoptose-Markern analysiert. Die neuroprotektive Wirkung von Ceftriaxon wurde durch direkte Zugabe an Neuronen der Zelllinie NG-108-15 untersucht. Des Weiteren wurden NG-108-15 Neuronenkulturen für 24 Stunden mit Astrozyten-konditioniertem-Medium (AKM) kultiviert, welches von Glutamat/Vehikel- oder Glutamat/Ceftriaxon-behandelten Astrozyten stammte. Mittels Messung der Caspase-Glo3/7-Aktivität oder durch Färbung mit Acridinorange / Ethidiumbromid wurde die Apoptoserate der neuronalen Zellen analysiert. Die Glutamat-Konzentration in primären Astrozyten der Ratte und im AKM wurde fluorometrisch bestimmt. Ergebnisse: Durch eine 6- bis 24-stündige Vorbehandlung mit Ceftriaxon konnte im Vergleich zur Vehikelbehandlung eine signifikante Reduzierung der Bax-mRNA- und IL-6 -mRNA-Expression in den Glutamat-behandelten Astrozytenkulturen nachgewiesen werden. Glutamat steigerte signifikant die NGFβ-mRNA-Expression in Astrozyten, was durch eine Ceftriaxon Vorbehandlung noch verstärkt wurde. Die Apoptoserate neuronaler Zellen war bei Kultur in AKM von Ceftriaxon/Glutamat-behandelten Astrozyten wesentlich geringer als bei Kultur in AKM von Vehikel/Glutamat- behandelten Astrozyten. Ceftriaxon allein hatte keinen direkten neuroprotektiven Effekt auf Glutamat-behandelte Neuronenkulturen. Durch Ceftriaxon konnte jedoch die Glutamat-Aufnahme in Astrozyten gesteigert und die Glutamat-Konzentration im Kulturmedium reduziert werden. Schlussfolgerung: Durch Ceftriaxon wird in Glutamat-behandelten Astrozytenkulturen die Apoptose und Entzündung reduziert und die Expression von neurotrophen Faktoren induziert. Ceftriaxon hat keinen direkten Effekt auf Glutamat-behandelte Neuronen aber AKM von Glutamat/Ceftriaxon-behandelten Astrozyten wirkt neuroprotektiv. Die protektive Wirkung der Ceftriaxon-behandelten Astrozyten auf die neuronalen Zellkulturen scheint einerseits durch eine Ceftriaxon- vermittelte Steigerung der Glutamat-Aufnahme in die Astrozyten, andererseits durch deren vermehrte Expression von Neurotrophinen bedingt zu sein.

Introduction: For decades, there has been a search for improved therapy for patients after stroke. Novel insights into the function of astrocytes within the neural network have stimulated new approaches. Astrocytes are able to absorb and metabolise extracellular glutamate, a key mediator of excitotoxicity, via a specific transporter, GLT-1. Previous studies found that the ß-lactam antibiotic ceftriaxone acted neuroprotective in various disease models by increasing the expression and activity of GLT-1. It was hypothesized that increased GLT-1 expression/activity leads to reduction of glutamate levels and thereby dampens excitotoxicity. Our group could show that in rats undergoing transient middle cerebral artery occlusion ceftriaxone reduced the 24- hour mortality rate by reducing the infarct size and by increasing the number of surviving neurons within the penumbra. This dissertation aimed at analysing the neuroprotective mechanism by which ceftriaxone reinforces the astrocytes’ protective effect on neurons in glutamate-induced excitotoxicity. Methods: Primary astrocytes were isolated from postnatal rats. Cells were pre- treated with ceftriaxone for 6, 12 or 24 hours before application of glutamate followed by another 12 hour incubation with ceftriaxone. Gene expression of pro-inflammatory cytokines, neurotrophins and markers for apoptosis was analysed by Real-time RT-PCR (qRT-PCR). The putative protective effect of ceftriaxone on neurons was tested by administering ceftriaxone directly to cells of the neuronal cell line NG-108-15, which were challenged with glutamate. In another approach, which focused on the astrocyte-neuronal interplay: NG-108-15 neuronal cells were cultured in astrocyte-conditioned medium (ACM), obtained from ceftriaxone/glutamate-treated astrocytes. After 24 hours of incubation, glutamate-induced apoptosis of neuronal cells was estimated by staining with acridine orange / ethidium bromide or the measurement of the enzymatic activity of caspases 3 and 7. Furthermore, glutamate content in astrocytes and the ACM was determined. Results: Pre- treatment with ceftriaxone over 6 to 24 hours significantly reduced the expression of IL-6 mRNA and pro-apoptotic Bax in primary astrocytes challenged with glutamate when compared to vehicle. Glutamate induced the expression of the neurotrophin NGFb in astrocytes, and this effect was further enhanced by pre-treatment with ceftriaxone. Apoptosis of neuronal cells in culture was significantly less when cells were incubation in ACM derived from glutamate /ceftriaxone-treated astrocytes when compared to ACM of glutamate/vehicle- treated astrocytes. However, ceftriaxone had no direct protective effect on glutamate-challenged neuronal cells. We could further show that ceftriaxone increased glutamate uptake by astrocytes and thereby lowered glutamate levels in the culture medium. Conclusion: Ceftriaxone reduces inflammation and apoptosis and induces neurotrophin expression in astrocytes challenged with glutamate. Ceftriaxone has no direct effect on glutamate-challenged neuronal cells, but ACM derived from glutamate/ceftriaxone-treated astrocytes acts neuroprotective. The mechanism by which ceftriaxone-treated astrocytes protect neuronal cells seems to be based on the enhanced glutamate uptake and increased synthesis of neurotrophins by astrocytes.