High Molecular Weight Polyglycerol based Nanocarriers for Gene Delivery

Abstract

The scientific goals of this work were the synthesis of a library of various high molecular weight hPG amines and their evaluation in biomedical applications in vitro and in vivo. As a first step, the synthetic pathway for high molecular polyglycerol was investigated. Thereby, the dependency of the resulting molecular weights on the used solvent was studied. Using 1,4-dioxane led to molecular weights higher than 400 kDa. Changing the solvent to THP enables the synthesis of 50 kDa up to 300 kDa. Furthermore, the ratio between the monomer and the solvent directly correlates with the final molecular weight, for instance, a molecular weight of 100 kDa was reached with an 1:2 ratio of THP:glycidol. All these results were produced in parallel to the research group of D. Brooks and published similarly by them in 2013.[113] The second aim, the up-scaling of the reaction was successfully performed for 100 kDa hPGs, with batch sizes up to 120 g. (Submitted to Biomaterial Science) Conclusively, the scientific goal to establish synthetic pathways for higher molecular weight polyglycerols in the research group of Prof. Haag was successfully performed as well as the up-scaling in the case of the 100 kDa hPG. The biomedical evaluation of different hPG amines as non-viral gene delivery vectors was shown in three different strategies. As a first hint, two different loaded nPG amines were synthesized and their charge dependently cellular uptake was studied. It was shown that the lower charged nanogel exhibits a better cellular uptake, but was less efficient in the ability of binding to DNA. In contrast the higher loaded one had a 10 times better binding affinity, but due to the high charge density, its toxic side effects were enhanced dramatically. In the second study, performed in parallel to the third, the effects of charge density and size were evaluated in vitro and in vivo. With the restriction of a maximal effective charge density on one hPG core, two different sizes were tested. It could be shown that there is a linear dependency between the multiplicity of amine groups and the zeta potential. Furthermore, the optimized candidate related to size, charge and multiplicity performed the best. It was demonstrated that this moderately loaded nanocarrier can challenge the standard “invivofectamin”. These really awesome results are in one line with the ones from the third study. In this one, a library of hPG amines, with varying molecular weight and loading of amine groups, was tested for DNA transport in vitro. It was shown that high and low loaded hPG amines are useless for DNA delivery, because they are either too toxic or not strong enough to complex the DNA sufficiently. Only the moderate loaded hPG amines showed really great and sufficient DNA delivery into the cells during cellular uptake. Interestingly, the best candidate had a molecular weight of 200 kDa, which was neither the biggest size nor the best charge density. Taken together, all scientific goals were successfully addressed. I was able to synthesize hPG amines with loadings from 1-100% and sizes from 50 kDa up to 700 kDa. The size to charge dependency as well as the multiplicity could be shown, resulting in an efficient matrix, which can be used as basis for further studies. With this in hand, we are now able to challenge every special biological application needing an adjustable carrier system. As an outlook, these scaffolds can be used as carriers for proteins, amino acids or sugar moieties, due to their ability to selectively adjust size and surface properties. Based on electrostatic interactions or covalent bonds, the cellular uptake can be improved and the efficiency of the counterpart can be increased. Furthermore, the hPG amine scaffold can be used with targeting ligands to enhance the ability of selective targeting. Such an optimized system could be able to reach the site of action more efficiently as shown in the second study and improve its efficiency.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Vielzahl verschiedener Polyglycerol Amine (hPG Aminen) synthetisiert und evaluiert. Die dabei im Wesentlichen verfolgten wissenschaftlichen Ziele waren zum einen die reproduzierbare Herstellung unterschiedlich großer hPG Amine und zum anderen ihre Verwendung als nicht virale Gentransporter in vitro und in vivo. Zu Beginn der Arbeit wurde die Synthese hochmolekularer hPG Amine etabliert. Es zeigte sich, dass allein durch den Wechsel der Lösungsmittel zwei unterschiedlich große Molekulargewichtsbereiche erzielt werden konnten. Unter Verwendung des Lösungsmittels 1,4-Dioxan wurden Molgewichte über 400 kDa erreicht, bei THP zwischen 50 kDa und 300 kDa. Dabei ist das Verhältnis von Glycidol zu THP der entscheidende Faktor für die finale Größe des Partikels, zum Beispiel bei einem 2:1 Verhältnis von Glycidol zu THP erreicht man ein Molekulargewicht von 100 kDa. Die Forschungsgruppe um D. Brooks (Kanada) erzielte zeitgleich ähnliche Ergebnisse über die lösungsmittelabhängige Synthese hyperverzweigter hochmolekularer Polyglycerole und publizierte sie als erste 2013.[113] Nach erfolgreicher reproduzierbarer Synthese unterschiedlich schwerer hPG Amine wurde in der finalen Phase der Doktorarbeit die großtechnische Produktion von 100 kDa Polyglycerolaminen durchgeführt und Ansatzgrößen bis zu 120 g verwirklicht. Die biologische Evaluierung der hergestellten hPG Amine als nicht-virale Gentransporter wurde in drei unterschiedlichen Studien durchgeführt. In der ersten wurde die zellulare Aufnahme zweier nPG Amine in Abhängigkeit der Beladungsdichte von Amingruppen an der Oberfläche untersucht. Diese Studie gab einen ersten Einblick in das Verhalten eines extrem positiven und einem fast neutralen Systems. Während das stark positive nPG Amin eine 10-fach höhere DNA Bindungsstärke aufwies, überzeugte das fast neutrale nPG Amin mit einer wesentlich besseren Aufnahme in die Zelle. Ähnliche Ergebnisse wurden in den zwei weiteren Studien beobachtet. Die zweite Studie untersuchte die Abhängigkeit der Transfektionseffizienz von der effektiven Ladungsdichte. Da die Ladungsdichte kerngrößenabhängig ist, wurden zwei Kerngrößen untersucht; ein 8 kDa und ein 43 kDa hPG Amin mit fünf verschiedenen Aminbeladungen. Es stellte sich heraus, dass das 43 kDa hPG Amin mit der besten effektiven Ladungsdichte auch die beste Knockdown Effizienz aufwies, bzw. zu vergleichbaren in vivo Ergebnissen wie der Goldstandard „Invivofectamin“ führte und dabei sogar eine bessere Effizienz erreichte. In der parallel zur zweiten durchgeführten dritten Studie wurde eine Vielzahl von unterschiedlich großen und beladenen hPG Aminen untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle Partikel mit Aminbeladungen über 80% in vitro zelltoxisch wirkten. Beladungsgrade von unter 15% erreichten keine effektive Stabilisierung der DNA, waren dafür aber komplett nicht toxisch. Deshalb wurde die Studie auf alle moderat geladenen hPG Amine konzentriert. Entgegen der Ergebnisse der zweiten Studie war nicht das 400 kDa hPG Amin mit der besten effektive Ladungsdichte das effizienteste Transportsystem, sondern das hPG Amin mit einer Kerngröße von 200 kDa. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass alle wissenschaftlichen Ziele der Arbeit erfolgreich umgesetzt wurden. Es wurden verschiedene hPG Amine mit Aminbeladungen von 1 bis 100% und mit Molekulargewichten von 50 kDa bis 700 kDa hergestellt. Die größenabhängige und ladungsabhängige Wirkung der Systeme in vitro und in vivo wurde evaluiert und es konnte gezeigt werden, dass moderat beladene hPG Amine die besseren Transportsysteme sind. Als Ausblick sollte man auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse die weitere Optimierung dieser einfach zugänglichen Transfektions Systeme erwägen. Zum einen könnte die Selektivität gegenüber einer ganz bestimmten Zelllinie weiter entwickelt werden. Dies wird im Allgemeinen durch die Einführung von unterschiedlichen Targetingeinheiten erreicht. Mit Erhöhung der Selektivität könnte man ggf. die Transfektionseffizienz weiter steigern. Zum anderen kann man das Gerüst als Transporter für Peptide, Aminosäuren oder Kohlenhydrate benutzen, um deren Aufnahme in die Zelle zu fördern. Da Peptide eine geringe eigene Aufnahme in die Zelle haben, wäre ein z.B. auf elektrostatische Interaktionen basierter Transport mit den hPG Aminen möglich.