dc.contributor.author
Kaulfuß, Stefan
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:21:46Z
dc.date.available
2010-01-04T12:31:22.674Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11827
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16025
dc.description
Abkürzungen………………………………………………………………………………….5 1
Einleitung........................................................................................................
7 1.1 Monozyten und
Makrophagen...................................................................
7 1.1.1 Die Biologie der Makrophagen im
Immunsystem.................................. 7 1.1.2 Aktivierung von
Makrophagen............................................................... 8
1.1.3 Makrophagensubpopulationen in der Maus und deren
Oberflächenrezeptoren......................................................................................
11 1.1.4 Toll-like Rezeptoren und die angeborene
Immunität........................... 15 1.1.5 Funktionen der Makrophagen
............................................................. 21 1.1.6
Antigenpräsentation
............................................................................
23 1.1.7 T-Zellantwort
.......................................................................................
24 1.2 Zytokine
....................................................................................................
26 1.2.1 Chemotaktische Zytokine (Chemokine)
.............................................. 27 1.3 Übersicht der
Herpesviren
...................................................................... 30 1.4
Das Murine Zytomegalievirus (MCMV)
................................................... 31 1.4.1 Die Biologie des
Murinen Zytomegalievirus ........................................ 31 1.4.2
Pathogenese der Zytomegalievirus Infektion
...................................... 32 1.4.3 Wirtsabwehr einer viralen
Infektion ..................................................... 32 1.4.4 MCMV
Immunevasion und -modulation .............................................. 37
1.4.5 MCMV und Monozyten/
Makrophagen................................................ 38 Ziel der
Arbeit......................................................................................................
41 2 Material und
Methoden.............................................................................
43 2.1 Materialien
................................................................................................
43 2.1.1 Herkunft der verwendeten
Reagenzien............................................... 43 2.1.2 Herkunft
der verwendeten Zelllinien....................................................
46 2.1.3 Verwendete Mausstämme
.................................................................. 47 2.1.4
Herkunft und Eigenschaften der verwendeten Virenstammlösungen.. 47 2.1.5
Herkunft der verwendeten
Antikörper.................................................. 48 2.1.6 Geräte
und Software
........................................................................... 50
2.1.7 Zusammensetzung von Medien und
Lösungen................................... 50 2.2 Methoden
..................................................................................................
52 2.2.1 Gewinnung von murinen Knochenmarksmakrophagen (BMM)........... 52
2.2.2 Gewinnung von murinen peritonealen Exsudatzellen (PEC)............... 52
2.2.3 Zellkultur
.............................................................................................
53 2.2.4 Herstellung der Virenstammlösung
..................................................... 54 2.2.5 Titration der
Virenstammlösungen mittels Plaque-Assay .................... 56 2.2.6 In vitro
Infektion...................................................................................
57 2.2.7 In vitro
Stimulation...............................................................................
57 2.2.8 Kopplung von Antikörpern mit Digoxigenin
......................................... 58 2.2.9
Durchflusszytometrie...........................................................................
59 2.2.10 Phagozytoseassay
..............................................................................
61 2.2.11
ELISA..................................................................................................
62 2.2.12 Bioplex-System (Cytometric bead assay)
........................................... 62 2.2.13
Klonierungen.......................................................................................
64 2.2.14 Real time PCR
....................................................................................
65 2.2.15 Konfokale Laserscanmikroskopie (cLSM)
........................................... 67 2.2.16 Transfektion von murinem
TLR4......................................................... 68 2.2.17
Transfektionen
....................................................................................
72 2.2.18 Polyacrylamidgelelektrophorese
(PAGE)............................................ 74 2.2.19 Immunoblot
.........................................................................................
75 3
Ergebnisse....................................................................................................
77 3.1 Charakterisierung von Knochenmarksmakrophagen (BMM) und Peritonealen
Exsudatzellen (PEC)
.............................................................. 77 3.1.1
Expression von Oberflächenmarkern auf BMM...................................
77 3.1.2 Expression von Oberflächenmarkern auf
PEC.................................... 80 3.1.3 Stimulation von Makrophagen
mit Lipopolysaccharid (LPS) ............... 80 3.2 Infektion von Makrophagen
mit dem Murinen Zytomegalievirus (MCMV) ……………………………………………………………………………………..82
3.3 Einfluss der MCMV-Infektion auf die Funktionalität von Makrophagen
……………………………………………………………………………………..84 3.3.1 MCMV verhindert die Produktion von
verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen durch Makrophagen
in
vitro..................................................................................................
84 3.3.2 MCMV blockiert die Produktion von Zytokinen und Chemokinen in
ruhenden und aktivierten Makrophagen.
............................................. 90 3.3.3 MCMV blockiert die
Transkription von Chemokinen in BMM ............ 105 3.3.4 MCMV reguliert die
Expression des Toll-like Rezeptors 4/ MD-2 Komplexes
herab...............................................................................
107 3.3.5 Analyse von Oberflächenrezeptoren auf MCMV-infizierten BMM im
Vergleich zu
TLR4.............................................................................
118 3.3.6 Analyse weiterer Funktionen von Makrophagen bei einer MCMV-
Infektion.................................................................................
121 3.3.7 Der Einfluss der MCMV Infektion auf die Funktionalität anderer
Zellen ………………………………………………………………………………126 3.4 Die Suche nach dem viralen Gen,
dass für die Blockade der Chemokinproduktion verantwortlich
ist............................................... 128 4
Diskussion..................................................................................................
133 4.1
Makrophagen..........................................................................................
133 4.2 Die Aktivierung von Makrophagen
....................................................... 134 4.3 Einfluss von
MCMV auf die Makrophagenfunktionen ......................... 135 4.3.1
Endozytose/ Herabregulation der TLR2 und 4 ..................................
135 4.3.2 Die MCMV Infektion verursacht eine Verlängerung der Überlebensdauer
von BMM in vitro. .................................................. 136 4.3.3
Der Einfluss der MCMV Infektion auf die Phagozytose und die Expression von
iNOS ........................................................................
136 4.3.4 Infektion von aktivierten
BMM........................................................... 137 4.4 Der
Einfluss von MCMV auf andere Zelltypen .....................................
139 4.5 Parakrine Effekte der MCMV-Infektion auf die uninfizierten Zellen. ..
139 4.6 Einordnung der Ergebnisse in das immunologische Gesamtgeschehen
……………………………………………………………………………………141 4.6.1 Lokale Immunsuppression durch die
akute MCMV-Infektion ............ 141 4.6.2 Der Einfluss von MCMV auf die
weitere Ausrichtung der Immunantwort ………………………………………………………………………………143 4.7
Ausblick
..................................................................................................
147 5 Zusammenfassung
..................................................................................
149 6
summary......................................................................................................
151 7
Literaturverzeichnis.................................................................................
153 8
Anhang.........................................................................................................
167 Ausgewählte Zytokine und Wachstumsfaktoren
........................................... 167 Vektorkarten
......................................................................................................
169
dc.description.abstract
Das Murine Zytomegalievirus (MCMV) ist ein an den murinen Wirtsorganismus hoch
angepasstes Pathogen. Diese Anpassung führte zur Entwicklung von einer
Vielfalt von Mechanismen, um der Erkennung und Elimination durch das
Immunsystem des Wirts zu entgehen. Damit gelingt dem Virus nach der akuten
Infektion des immunkompetenten Wirts die Etablierung einer lebenslang
persistierenden Infektion, unter anderem in den Zellen der myeloiden Linie,
wobei vor allem den zirkulierenden Monozyten ein wichtige Rolle zur
Verbreitung des Virus im Wirtsorganismus zu kommt. Die Aufgabe dieser
Makrophagen ist die frühe Erkennung von Pathogenen über Oberflächenrezeptoren,
die Freisetzung von Mediatoren und antimikrobielle Aktivitäten. Die frühe
Phase der Immunantwort gegen MCMV ist gekennzeichnet durch die Produktion von
Chemokinen, die Effektorzellen rekrutieren und aktivieren. Eine der
Hauptquellen der Mediatorenproduktion sind die Zellen der myeloiden Linie und
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen). In dieser Arbeit konnte erstmals auf
Einzelzellebene gezeigt werden, dass MCMV Makrophagen infiziert und dabei mit
der Produktion von löslichen Mediatoren wie Chemokinen und Zytokinen sowie
essentiellen immunologischen Funktionen dieser Zellen interferiert. In
ruhenden Makrophagen wurde die Aktivierung und nachfolgende Produktion von
Chemokinen (MIP-1α, MIP-1β, RANTES und MCP-1), Zytokinen (IL-6, IL-12, IL-15,
IL-18 und TNF-α) und Stickstoffmonoxidradikalen durch mikrobielle Bestandteile
durch die Infektion mit MCMV blockiert. Diese Blockade durch MCMV wurde durch
die Herabregulation der Oberflächenrezeptoren für die Erkennung der
pathogenassoziierten Strukturen Toll-like Rezeptor 2 (TLR2) und TLR4
verursacht, was zu einem Stopp der Transkription der Chemokine führte. Dies
führte dazu, dass MCMV-infizierte Zellen Chemokine sowie einige Zytokine nicht
mehr produzieren konnten, die zur Ausbildung einer effektiven TH1-Zellantwort
notwendig sind. In aktivierten Makrophagen wurde durch MCMV die bereits
eingesetzte Produktion der löslichen Mediatoren herabreguliert. Die MCMV-
infizierten Makrophagen sind daher hinsichtlich der Erkennung und Elimination
von Pathogenen und der nachfolgenden Immunantwort paralysiert. MCMV
interferiert ebenfalls mit anderen essentiellen Funktionen der Makrophagen wie
der Phagozytose von Dextran und der Expression von immunologisch relevanten
Oberflächenmarkern (CD29, CD80, CD86 und CD115). Damit umfasst die MCMV-
induzierte Paralyse der Makrophagen die drei funktionellen Hauptbereiche
dieser Zellen: die interzelluläre Kommunikation (und Kostimulation), die
Pathogenerkennung und die mikrobiziden Aktivitäten zur Pathogenbeseitigung.
MCMV entgeht dadurch der primären Immunantwort trotz einer kurzzeitigen
lokalen Aktivierung des Immunsystems, um durch die Mobilität der Makrophagen
bzw. Monozyten in immunologisch privilegierte Regionen zu gelangen. Innerhalb
der akuten primären Infektion könnte eine lokale, transiente Immunsuppression
ein wichtiger Mechanismus zur viralen Verbreitung im Wirt sein. Die Ergebnisse
dieser Arbeit beschreiben einen möglichen Mechanismus, der die beobachtete
transiente Immunsuppression in akut MCMV-infizierten Mäusen erklärt.
de
dc.description.abstract
The murine cytomegalovirus (MCMV) is a highly adapted pathogen and has
developed numerous strategies to escape the host immune response. Using
different escape mechanisms the virus is able to establish a lifelong
persistent infection in immunocompetent hosts. Amongst others, myeloid cells
are latently infected. Part of the latently infected cells are circulating
monocytes, which play an important role in virus dissemination. The main
functions of monocytes and macrophages are the early recognition of pathogens
with respective surface receptors, the secretion of soluble mediators and
other antimicrobial activities. The early phase of the immune response against
MCMV is characterized by the production of chemokines which subsequently
recruit and activate effector cells. One of the main sources of chemokines are
myeloid cells and natural killer cells. In the current work it was shown for
the first time at the single cell level that MCMV infects macrophages and
thereby impairs the production of chemokines, cytokines and other essential
immunological functions. MCMV blocked the activation of resting macrophages by
microbial substances and the subsequent production of chemokines (MIP-1α, MIP-
1β, RANTES and MCP-1), cytokines (IL-6, IL-12, IL-15, IL-18 and TNF-α) and
nitric oxid. The blockade by MCMV was achieved by downregulating of the
surface receptors TLR2 (toll like receptor 2) and TLR4 leading to a stop of
chemokine gene transcription. Hence MCMV infected macrophages were not able to
produce chemokines and cytokines necessary for an effective TH1-immune
response. In activated macrophages MCMV downregulated the ongoing production
of the above mentioned soluble mediators. Additionally, MCMV interfered with
other essential macrophage functions: the phagocytosis of dextran and the
expression of immunological important surface receptors (CD29, CD80, CD86 and
CD115). MCMV infected macrophages are therefore paralysed with respect to the
recognition and elimination of microbial pathogens. Thus the MCMV induced
paralysis of macrophages affects three main functions of phagocytes: the
intercellular communication (and costimulation), the detection of pathogens
and antimicrobial activities. Using these strategies MCMV is able to evade the
primary immune response despite a short-time and local immune activation and
uses the mobility of monocytes and macrophages to disseminate and reach
immunological privileged sites in the host. As a result, an acute infection
could lead to a local and transient immune suppression that might be an
important strategy of viral dissemination. The results of this work describe a
possible mechanism which may explain the transient immune suppression observed
in acute MCMV infected mice.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
innate immunity
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Modulation von Makrophagenfunktionen durch das Murine Zytomegalievirus (MCMV)
dc.contributor.contact
stefan.kaulfuss@gmx.net
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Roland Grunow
dc.date.accepted
2009-03-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000012118-1
dc.title.translated
Modulation of macrophages functions by the murine cytomegalovirus (MCMV)
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000012118
refubium.mycore.derivateId
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open access