Phänotypische und molekulargenetische Untersuchungen an Poliovirus Serotyp 1-Isolaten eines Poliovirus-Dauerausscheiders

Abstract

Ein biologisches Prinzip bei der Poliomyelitis-Eradikation war, dass keine chronischen Poliovirusinfektionen vorkommen. Seit der Einführung der oralen Poliovakzine (OPV) wurden jedoch wenige Fälle von verlängertem Ausscheiden von Vakzin-abgeleiteten Polioviren (VDPV) beobachtet. Ziel der Arbeit war es, zwei Isolate eines in Deutschland lebenden, immundefizienten Poliovirus-Daueraus- scheiders mit Fokus auf die Poliovirusvariabilität phänotypisch und genotypisch zu untersuchen. Der Patient entwickelte im Jahr 2000 eine paralytische Poliomyelitis (letzte OPV-Gabe 1998) und scheidet seit dem Poliovirus Serotyp 1 aus. Die Untersuchungen der Isolate (aus den Jahren 2000 und 2004) basierten auf üblichen Methoden zur intratypischen Differenzierung sowie auf Totalsequenzen, die nach molekularer Klonierung von Teilamplifikaten ermittelt wurden. Es konnte gezeigt werden, dass beide Isolate auf phänotypischer Ebene (ELISA, rct-Marker) „Non-Sabin-like“, genotypisch (Diagnostik-PCR) dagegen „Sabin-like“ reagierten. Die molekulare Feincharakterisierung ließ eine Einordnung beider Isolate als VDPV zu, welche durch die phylogenetische Analyse der Region VP1-2A bestätigt wurde. Die weitere Sequenzanalyse ergab eine hohe genetische Variabilität in Bezug auf die Sabin Typ 1-Sequenz sowie eine im Verlauf der Infektion gestiegene Mikroheterogenität. Dabei zeigte sich, dass die Nukleotid(NS)- und Aminosäuren (AS)-Substitutionsraten in Teilbereichen des Genoms variierten: die höchsten Raten wurden in dem Abschnitt VP2-2B ermittelt, die Regionen VP4 und 3A-3C waren insbesondere auf AS-Ebene stark konserviert. Der hohe Anteil an synonymen NS- und konservativen AS-Mutationen wies darauf hin, dass die Variabilität v.a. durch neutrale Mutationen getragen wurde. Die putativen Motive der Proteasen und Polymerase, sowie RNA-Sekundärstrukturformationen waren hochgradig konserviert. Hinweise auf positive Selektionen von Mutationen ergaben sich an Positionen, die mit der Attenuierung assoziiert sind und bei beiden Isolaten die Wildtyp-spezifische Besetzung aufwiesen, sowie im Bereich der neutralisierenden, antigenen Determinanten bzw. an Positionen, die mit dem zellulären Poliovirus-Rezeptor interagieren.

One of the biological principles of the poliomyelitis eradication initiative was, that there were no chronic poliovirus infections. However, since the introduction of the oral poliovaccine (OPV) by Albert Sabin some few cases of prolonged excretion of vaccine-derived polioviruses (VDPV) were observed. The aim of this work was to investigate two sequential isolates of a german poliovirus long-term excretor with focus on the variability in their phenotypic and genomic properties. The patient developed a paralytic poliomyelitis in the year 2000 (the last OPV administration was 1998) and is still excreting poliovirus serotype 1. The investigation of the isolates (from the year 2000 and 2004) based on common methods for intratypic differentiation of poliovirus isolates and on complete genomic sequences, which were determined after molecular cloning of partial amplificates. Both isolates showed “non-sabin-like” characteristics on phenotypic level (ELISA, rct-test) but were characterized as “sabin-like” on genomic level (diagnostic PCR). Further molecular characterization of both isolates led to the classification of VDPVs, which was confirmed by phylogenetic analysis in the genome-region VP1-2A. Sequence analysis revealed a high genomic variability and an increasing microheterogeneity during the course of infection. Nucleotide(NS)- and aminoacid(AS)-substitutions varied over different parts of the genome: the highest substitution rates were observed in the region VP2-2B, where as the regions VP4 and 3A-3C - especially on AS-level – showed to be highly conserved. The high proportion of synonymous NS- and conserved AS- substitutions pointed out, that the sequence variability was mostly sustained by neutral mutations. Putative motifs of the viral proteases and the polymerase and also RNA-regions with an high proportion of secondary structure formation were highly conserved. However, evidence for positive selection of mutations were detected at positions, which were associated with attenuation of neurovirulence and which showed in both isolates reversions to the wildtype sequence, in the region of the neutralizing antigenic sites as well as at positions, which interact with the cellular poliovirus receptor.