In vitro Untersuchungen zellulärer Effekte nach Exposition mit polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen und endokrinen Disruptoren mittels Metabolomanalysen: Identifizierung von Biomarkern für die Risikobewertung und Einblick in toxikologisch relevante Stoffwechselwege in HaCaT und MCF-7 Zellen

Abstract

In der vorliegenden Dissertation wurde Metabolomics mit zellulären Methoden kombiniert, um die Entwicklung neuer, auf toxischen Mechanismen basierenden, in vitro Testmethoden für die Risikobewertung von verbrauchernahen Chemikalien, insbesondere von Substanzmischungen, voranzutreiben. Im ersten Teil wurden erstmals die Wirkungen drei verschiedener PAKs CRY, BAP und DALP unterschiedlicher karzinogener Potenz und AHR Bindungsaffinität auf das Metabolom in HaCaT Zellen untersucht. Unterschiede in der CYP-Expression, sowie Viabilität exponierter Zellen zeigten die differentielle AHR-abhängige Wirkweise der drei PAKs. Über einen zielgerichteten Metabolomics Ansatz wurden 24 Metabolite als Biomarker identifiziert, welche die distinkte Wirkweise der einzelnen Verbindungen der Substanzgruppe der PAKs weitergehend herausstellten. Einflüsse auf den Energiestoffwechsel und den Lipidmetabolismus wurden hierbei abgeleitet. Im zweiten Teil wurden Effekte von E2, BPA und Cd2+ auf MCF-7 Zellen untersucht. Erstmals wurde eine Gruppe von elf Biomarkern identifiziert, welche nach E2 sowie nach BPA Exposition reguliert und daher mit estrogenen Effekten assoziiert wurde. Ko- Expositionsexperimente mit E2 oder BPA und dem Schwermetall Cd2+ zeigten lediglich einen geringen modulierenden Einfluss von Cd2+ auf das veränderte Metabolitmuster. Zelluläre Testmethoden, wie Expressionsexperimente zu ER- Zielgenen, zeigten keine Effekte durch Cd2+ in der Ko-Exposition. Die Aminosäure Pro wurde als estrogener Biomarker identifiziert. Eine Korrelation des Anstiegs der Pro-Konzentrationen mit Proliferationseffekten wurde bestätigt. Weiterführende Experimente zeigten die Abhängigkeit der Pro-Level- Erhöhung von ER-alpha. Außerdem wurde ein Einfluss des Onkogens MYC auf den betreffenden Signalweg ermittelt. Im dritten Teil wurden 18 Lipidbiomarker in MCF-7 Zellen für die Ko-Exposition von BAP und Cd2+ identifiziert. Das metabolomische Profil zeigte synergistische Effekte von BAP in Kombination von Cd2+. Als Schlüsselsignalweg wurde eine durch PC-PLC Aktivierung verstärkte Aktivierung des EGFRs HER2 identifiziert, welcher mit proliferativen und karzinogenen Eigenschaften der Testsubstanzen in Verbindung gebracht wurde. Durch gezielte Inhibition von Schritten im identifizierten Signalweg wurde ein mechanistischer „Kaskaden-Biomarker-Ansatz“ erarbeitet. Dieser wurde als in vitro Testsystem für Ko-Expositionen von PAKs, wie BAP, mit Schwermetallen, wie Cd2+, postuliert. Die Anwendbarkeit dieses Ansatzes für die Erfassung additiver und synergistischer Effekte wurde gezeigt. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen das hohe Potenzial von Metabolomics Methoden für den Einsatz in der Risikobewertung. Es wurden neue metabolomische Biomarker identifiziert. Außerdem wurden über ergänzende zelluläre Methoden, sowie Anwendung spezifischer Inhibitoren, Einblicke in toxische Signalwege gewonnen. Darüber hinaus wird ein neuartiger Ansatz für ein in vitro Testsystem für Mischexpositionen präsentiert.

In the presented work, metabolomics was combined with cellular assays, in order to promote the development of new, mechanism based, in vitro test systems for risk assessment of consumer related chemicals, especially of substance mixtures. In the first part, effects on the metabolome of HaCaT cells triggered by the three different PAHs: CRY, BAP and DALP were investigated for the first time. The studied PAHs possess different carcinogenic potencies and affinities to bind the AHR. Differences in CYP- expression and viability of exposed cells showed the distinct effects of the studied PAHs depending on AHR activation. A targeted metabolomics approach revealed 24 metabolomic biomarkers which further pointed out the differential effects of the investigated PAHs. Metabolite level changes indicated influences on energy and lipid metabolism. In the second part, effects of E2, BPA and Cd2+ on the metabolome of MCF-7 cells were investigated. For the first time, a set of eleven estrogenic biomarkers was identified that were regulated similarly upon E2 and BPA exposure. Co-exposure experiments of E2 or BPA, with or without the heavy metal Cd2+, showed a slight modulation of the estrogenic metabolite pattern. Cellular assays, e.g. expression studies of ER target genes, revealed no effects of Cd2+ in co-exposure experiments. The amino acid Pro was identified as most prominent estrogenic biomarker. Pro increase could be correlated with proliferation in the studied MCF-7 cells. Mechanistic investigations confirmed ER-alpha dependency. Further, the underlying signaling was found to involve the oncoprotein MYC. In the third part, 18 lipid biomarkers were identified in MCF-7 cells for co-exposure of BAP and Cd2+. The metabolomic pattern showed synergistic effects of BAP in combination with Cd2+. An increased activation of EGFR HER2 caused by enhanced activation of PC-PLC activation was identified as key signaling pathway. Activation of this mechanism was associated with proliferative and carcinogenic potencies of the test chemicals. Based on specific inhibition of steps in the identified pathway and examination of the resulting metabolomic pattern changes, a mechanistic “cascade biomarker approach” was established. This was postulated as in vitro test system for co-exposure scenarios of PAHs, like BAP, with heavy metals, like Cd2+. The approach is further suitable for the detection of additive and synergistic effects. This work shows the high potential of metabolomics approaches for the application in toxicological risk assessment. New metabolomic biomarkers were identified. Further, insights into the underlying toxic signaling pathways were gained through application of cellular assays and specific inhibitors. Moreover, a new approach for an in vitro test system for mixture toxicology is presented.