Untersuchungen zur Wirkung von Saponinen als Verstärker der Penetration von Proteinen im Zellmodell

Abstract

Triterpenoide Saponine aus Gypsophila paniculata L. sind dafür bekannt, die Zytotoxizität spezieller Toxine drastisch zu steigern. Bei diesen Toxinen handelt es sich um Ribosomen-inaktivierende Proteine Typ I (RIPs Typ I), die durch ihre N-Glycosidase-Aktivität einen essentiellen Adeninrest von der ribosomalen RNA abspalten, so dass die Proteinsynthese zum Erliegen kommt. Bisherige Untersuchungen führten die Saponin abhängige außerordentliche Zytotoxizitätssteigerung Ribosomen-inaktivierender Proteine Typ I auf eine Saponin induzierte Modulation der Endozytose oder Phagozytose zurück. Ausgehend von dieser Arbeitshypothese wurden nach Etablierung geeigneter In- vitro-Modelle die Endozytose, Exozytose und Phagozytose modulierenden Eigenschaften der Gypsophilasaponine untersucht. Durch Gypsophilasaponine konnte jedoch weder die Phagozytose nichtopsonierter oder opsonierter Escherichia-coli-Bakterien noch die Aufnahme von Latex-Partikeln induziert werden. Die weiteren, im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen hatten die Charakterisierung der synergistischen Zytotoxizität zum Ziel. In ECV-304-Zellen wurde die GI50 des Saporins (RIP Typ I), in Kombination mit Gypsophilasaponinen mit 42×10−12 M bestimmt und war mit der GI50 (21×10−12 M) des hoch toxischen Ribosomen-inaktivierenden Proteins Typ II, Viscumin, vergleichbar. Diese außerordentliche Toxizitätssteigerung des Saporins war nicht auf ECV-304-Zellen beschränkt und konnte in weiteren sechs humanen Zelllinien beobachtet werden. Dies deutet auf einen allgemeinen Saponin abhängigen Mechanismus der Zytotoxizitätssteigerung Ribosomen-inaktivierender Proteine Typ I hin. Die Beobachtung, dass Inhibitoren der Clathrin vermittelten Endozytose zu einer Hemmung der Saponin/Saporin-Zytotoxizität führten, unterstreicht zudem die Bedeutung der Clathrin vermittelten Endozytose bei der Saporininternalisierung. Gypsophilasaponine übten jedoch weder einen stimulatorischen Einfluss auf die Clathrin vermittelte Endozytose noch auf die Exozytose internalisierten Saporins aus. Ein modulatorischer Einfluss der Gypsophilasaponine auf den Saporinabbau konnte ebenfalls ausgeschlossen werden. Weitere im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Untersuchungen deuten auf eine Saponin induzierte, endosomale Freisetzung der mittels Clathrin vermittelter Endozytose internalisierten RIPs Typ I hin. Dieser, im Angloamerikanischen als endosomal escape bezeichnete, durch Gypsophilasaponine katalysierte Saporintransfer liegt der außerordentlichen Saporin-Toxizitätssteigerung als Mechanismus zu Grunde. Da die Endosomenmembran nicht vollständig lysiert wird und nur sehr wenige Toxinmoleküle das Zytosol zu erreichen scheinen, kommt der enzymatischen Aktivität des Saporins mit 140 pmol Adenin/pmol Saporin pro Stunde eine besondere Rolle zu. Dadurch kann die geringe, Saponin vermittelte Saporintransfereffizienz auf zytosolischer Seite kompensiert werden. In Analogie zu den Ionophoren können Gypsophilasaponine demgemäß als Enzymophore aufgefasst werden.

Triterpenoid saponins from Gypsophila paniculata L. are known to enhance the cytotoxicity of type I ribosome-inactivating proteins (type I RIP). These proteins exhibit N-glycosidase activity and remove an essential adenine residue from the ribosomal RNA. Up to now it was assumed that the saponin- mediated toxicity enhancement of these toxins is due to a an increased endocytosis or phagocytosis in saponin treated cells. To scruntinize this hypothesis, appropriate in vitro models were established and the influence of Gypsophila saponins on endocytosis, exocytosis and on phagocytosis was investigated. Gypsophila saponins showed no influence on the phagocytosis of opsonated and non-opsonated Escherichia coli-bacteria. This was also observed for microspheres. In combination with Gypsophila saponins the cytotoxicity of saporin (type I RIP) was increased to a level similar to that of the highly toxic type II RIP rViscumin. rViscumin achieved an IC50 value of 21.5×10−12 M on ECV-304 cells and the combination of saporin with Gypsophila saponins 42.5×10−12 M. This tremendous toxicitiy enhancement was not restricted to ECV-304 cells but was observed in six further cell lines, indicating a general saponin dependent mechanism of toxicity enhancement of type I ribosome- inactivating proteins. It was further shown, that the internalization of saporin was mediated by clathrin-mediated endocytsosis. However Gypsophila saponins did not modulate the clathrin- mediated endocytosis of saporin. This was also shown for other transport processes such as exocytosis. Degradation processes of saporin were also not influenced by the saponins. Further experiments showed a saponin-mediated endosomal escape of the N-glycosidase saporin. Additional investigations indicate that only few saporin molecules traverse through the endosomal membrane into the cytosol of saponin-treated cells. These low saporin penetration rate through endosomal membranes could be balanced by the strong N-glycosidase activity of saporin with up to 140 pmol adenine/pmol saporin per h. In this context and in analogy to ionophores Gypsophila saponins could be defined as enzymophores.