Design and Synthesis of Crytpophane-based Functionalized Xenon Hosts for MRI applications

Abstract

Magnetic resonance imaging (MRI) is an emerging technique for “molecular” diagnostic imaging because of unlimited penetration depth, high spatial resolution and safeness. Currently there is a high demand for developing contrast agents to render the MRI information extremely specific. This has to be combined with efforts to address the well-known poor sensitivity of MRI. Detecting hyperpolarized non-proton nuclei, such as Xe that underwent spin exchange optical pumping is a suitable method that was the method of choice for this thesis because it enables a theoretical 107-fold signal enhancement in combination with indirect detection methods such as Chemical Exchange Saturation Transfer (Hyper-CEST). The molecular specificity in this approach is enabled through molecular cages such as Cryptophane-A (CrA), that temporarily bind Xe and are conjugate to a targeting unit. This work aims to advance the design and synthesis of Xe-based biosensors, in particular in the context of Hyper-CEST detection and NMR/MRI performance in cellular environments. In our preliminary studies, CrA monoacid (CrA-ma) was used to label cells and to study the response of labelled cells in Xe-NMR/MRI as a reference for functionalizes sensors. This was complemented by implementing dual sensors through conjugation of CrA-ma with fluorescent dyes. This allowed cell tracking and quantification through optical imaging techniques. The two dual sensors (bearing CrA-ma for Xe-MRI and FAM or TAMRA for optical imaging) were tested and used to develop a protocol for Hyper-CEST evaluation with respect to incubation conditions and cell viability in comparison with unfunctionalized cage. This revealed excellent correlation between the response in Xe-MRI and fluorescence cell analysis. In order to achieve a fast, efficient and flexible synthesis of the dual bisosensors, an optimization of the coupling reaction through microwave-assisted acylation was done. The new mw-assisted synthesis protocol allowed the synthesis of the first targeted biosensors produced in our group, which was an antibody-based anti-CD14 dual sensor. Such a sensor showed a very high specificity in targeting the cell surface receptor CD14 and CrA-ma was detected in Xe-MRI at nanomolar concentration. In an alternative approach, the possibility of targeting an enzyme was considered because, other than having information about the enzyme activity, a possible further signal amplification through the enzyme can be postulated. Matrix metalloproteinases (MMPs) are largely used in molecular imaging. CrA-ma probes targeting MMP-11 were synthesized first. However, the poor solubility of the probe was a point of concern though this work could demonstrate a better spectral dispersion after enzyme activation compared to previous studies. We decided therefore to address the new probe to MMP-2/9, a molecular target of considerable interest in cancer diagnostics. Furthermore, the new probe was based on an activatable cell penetrating peptide (ACPP). In such concept, the two read out modules (CrA-ma and FAM) were incorporated in a probe bearing a poly-D-Arg sequence and an inhibitory poly-D-Glu sequence, joined together by a cleavable consensus sequence. Upon proteolysis, our Xe- MRI data showed indeed a Hyper-CEST response of 80% for enzyme-bearing cellular environment and only 20% for the negative control. Overall, the approaches presented in this work represent key steps to illustrate the potential and robustness of the Hyper-CEST detection technique for molecular imaging thorough the design and synthesis of Xe-based biosensors building blocks and improved MRI performance in cellular environments.

Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist wegen ihrer unbegrenzten Eindringtiefe, hohen räumlichen Auflösung und großen Sicherheit innerhalb der sog. "molekularen" diagnostischen Bildgebung eine aufstrebende Methode. Derzeit gibt es einen starken Bedarf für die Entwicklung von Kontrastmitteln, die MRT-Aufnahmen einen spezifischen Kontrast verleihen. Dabei werden gleichzeitig Bemühungen nötig, welche die bekannt schlechte Sensitivität der MRT adressieren. Die Detektion von sog. hyperpolarisierten XKernen wie Xe, welche man durch optisches Spinaustausch-Pumpen erhält, ist hierfür eine geeignete Methode. Sie war auch die Methode der Wahl für diese Arbeit, weil sie in Kombination mit indirekten Nachweismethoden wie z.B Sättigungs-Transfer durch chemischen Austausch (Hyper-CEST) theoretisch eine ~107-fache Signalverstärkung ermöglicht. Die molekulare Spezifität dieses Ansatzes wird durch molekulare Käfige wie Cryptophan-A (Cr-A) ermöglicht, die temporär Xe binden und mit einer Targeting-Einheit gekoppelt werden. Ziel dieser Arbeit war das Design und die Synthese neuer Xe-Biosensoren, insbesondere in Zusammenhang mit der Hyper-CEST-Methode und deren Anwendung zur NMR/MRT- Auslese für zelluläre Proben. In diesen Machbarkeitsstudien wurde CrA-monoacid (Cr-ma) verwendet, um Zellen zu markieren und deren Auslese- Antwort in Xe-NMR /MRT-Experimenten als Referenz für spätere funktionalisierte Sensoren zu untersuchen. Dies wurde durch die Implementierung von dualen Sensoren mittels Konjugation von CrA-ma mit Fluoreszenzfarbstoffen ergänzt, was ein Zell- Tracking und eine Quantifizierung durch optische Verfahren ermöglichte. Die beiden dualen Sensoren (welche CrA-ma zur Xe-MRT-Auslese und FAM oder TAMRA zur optischen Detektion tragen) wurden charakterisiert und anschließend verwendet, um ein Protokoll für die Evaluierung von Hyper-CEST-Effekten hinsichtlich der Inkubationsbedingungen und der Zell-Viabilität im Vergleich zur Verwendung nicht-funktionalisierter Käfige zu entwickeln. Dabei ergab sich eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem Verhalten in der Xe-MRT und der Fluoreszenz-Analyse der Zellen. Um eine schnelle, effiziente und flexible Synthese der dualen Bisosensoren zu erreichen, wurde eine Optimierung der Kupplungsreaktion durch die mikrowellenunterstützte Acylierung vorgenommen. Das neue mw-unterstützte Synthese-Protokoll erlaubte in unserer Gruppe die Synthese der ersten Antikörper-basierten Sensoren (anti-CD14) in Form eines zielgerichteten, dualen Sensors. Dieser Sensor zeigte eine sehr hohe Spezifität für den Zelloberflächenrezeptor CD14 und die CrA-ma-Einheit konnte mittels Xe-MRT bei nanomolaren Konzentration nachgewiesen werden. In einem alternativen Ansatz wurde die Möglichkeit der gezielten Enzym-Detektion untersucht, da hierbei mit der Information über die Enzymaktivität auch eine Möglichkeit zur weiteren Signalverstärkung durch das Enzym selber einhergeht. Matrixmetalloproteinasen (MMPs) werden umfangreich in der molekularen Bildgebung untersucht. CrA-ma-Sonden, welche auf die Detektion von MMP-11 abzielen, wurden hier erstmals synthetisiert. Die schlechte Löslichkeit des Sensors war jedoch ein limitierender Faktor, obwohl in dieser Arbeit eine bessere spektrale Dispersion nach Enzymaktivierung im Vergleich zu früheren Studien gezeigt werden konnte. Wir beschlossen daher, einen neuen Sensor für MMP-2/9 zu entwickeln. Diese MMPs sind von großem Interesse in der Krebsdiagnostik. Der neue Sensor basiert auf einem aktivierbaren, zellpenetrierenden Peptid (ACPP). Bei diesem Konzept sind die zwei Auslesemodule (CrA-ma und FAM) des Sensors mit einer Poly-D-Arg-Sequenz und einer inhibierenden Poly-D-Glu-Sequenz gekoppelt. Letztere sind miteinander durch eine spaltbare Sequenz als Substrat von MMP-2/9 gekoppelt. Nach Proteolyse zeigten unsere Xe-MRT-Daten einen Hyper-CEST-Effekt von 80% für die Enzymtragenden zellulären 3 Umgebungen und nur 20% für die negative Kontrolle. Insgesamt sind die in dieser Arbeit vorgestellten Ansätze wichtige Schritte, um das Potenzial und die Robustheit des Hyper-CEST-Detektionstechnik für die molekulare Bildgebung durch Design und Synthese von Xe-Biosensor-Bausteinen und die verbesserte MRTDetektion in zellulärer Umgebung zu illustrieren.