dc.contributor.author
Rohde, Anna Maria
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:19:03Z
dc.date.available
2014-07-17T09:15:23.476Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11775
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15973
dc.description.abstract
The RING E3 ubiquitin ligases TRIM2, TRIM3, TRIM32 and LIN41/TRIM71 form the
mammalian TRIM-NHL protein family. They contain a characteristic domain
structure consisting of an N-terminal tripartite motif (TRIM) and a C-terminal
NHL domain. The TRIM-NHL proteins have reciprocal expression patterns in
development: LIN41 is highly expressed in stem cells and early embryos and is
downregulated during development, while expression of the other family members
TRIM2, TRIM3 and TRIM32 increases. Relatively little was known about the
function of TRIM-NHL proteins at the beginning of this thesis. In pluripotent
cells, LIN41 was shown to target ARGONAUTE2, the effector protein in the RNA-
induced silencing complex, for proteasomal degradation resulting in a
repression of microRNA activity. During differentiation, Lin41 is efficiently
downregulated at the transcriptional and at the post-transcriptional levels,
the latter by the combined action of let-7 and miR-125 (two differentiation-
associated microRNA). Homozygous Lin41 gene trap mice showed embryonic
lethality. Knockout mice of the other TRIM-NHL proteins were viable and
displayed various central nervous system phenotypes. The goal of the thesis
was to investigate potentially shared functions of TRIM-NHL proteins.
Therefore it was determined if TRIM32 and LIN41 interact with MYOSIN V (like
TRIM2 and TRIM3) and if LIN41 influences endosomal trafficking (like TRIM3).
The results presented in this thesis indicate that LIN41 and TRIM32 bind
MYOSIN V, but (unlike TRIM3) LIN41 does not influence endosomal trafficking.
Furthermore, the question of a LIN41 effect on pluripotency and of a possible
regulation of microRNA activity by the other TRIM-NHL proteins was addressed.
The results suggest that LIN41 affects pluripotency only indirectly and that
TRIM32, but not TRIM2 or TRIM3, is able to mimic LIN41 function in a microRNA
sensor assay. The major focus of this thesis was to investigate the potential
interplay between LIN41 and the other TRIM-NHL family members in early
neurodevelopment. In C. elegans, loss of the Trim32 ortholog was reported to
rescue the heterochronic phenotype of a hypomorphic lin-41 mutant,
demonstrating a genetic interaction between the two. To date, the idea that
mammalian TRIM-NHL proteins may directly and functionally interact has been
largely neglected. Using co-immunostaining, co-localization of all three other
TRIM-NHLs with LIN41 in cytoplasmatic foci of transfected cells was observed.
In sections of E11.5 embryos, co-staining of the four TRIM-NHL proteins in the
neuroepithelium was shown. Unexpectedly, the four TRIM-NHL proteins were also
co-expressed in pluripotent embryonic stem cells. Co-immunoprecipitation
employing E11.5 head extracts revealed an RNA-independent physical interaction
of TRIM2, TRIM3 and TRIM32 with LIN41. As all four TRIM-NHL proteins are
functional RING E3 ubiquitin ligases, this result indicates that they may act
in a combinatorial fashion. Mutual ubiquitination or change of target
specificity upon interaction of LIN41 and TRIM32 (which showed an almost
complete co-localization) was hypothesized. Indeed, LIN41 overexpression in
embryonic stem cells led to downregulation of TRIM32. Analysis of the global
ubiquitination landscape of embryonic stem cells revealed LIN41-driven
ubiquitination of TRIM32. TRIM32 is a pro-differentiation factor in neural
stem cells and enhances retinoic acid signaling. This suggests that LIN41 may
prevent premature differentiation of pluripotent cells at least in part by
regulating TRIM32 activity. Together, this research provides novel insight
into the developmental roles of LIN41 by elucidating its functional
interaction with other members of the TRIM-NHL family during mammalian
neurodevelopment.
de
dc.description.abstract
Die RING E3 Ubiquitinligasen TRIM2, TRIM3, TRIM32 und LIN41/TRIM71 bilden mit
ihrer charakteristischen Domänenstruktur, einer N-terminalen TRIM (tripartite
motif) und einer C-terminalen NHL-Domäne, die TRIM-NHL Proteinfamilie. In der
Säugetierentwicklung weisen TRIM-NHL Proteine entgegengesetzte
Expressionsmuster auf: LIN41 ist in Stamzellen und in frühen
Entwicklungsstadien stark exprimiert. Diese Expression wird im Verlauf der
Entwicklung herunterreguliert, während die Expression von TRIM2, TRIM3 und
TRIM32 ansteigt. Die Funktion der TRIM-NHL Proteine war zu Beginn der hier
vorliegenden Dissertation weitestgehend unbekannt. Für LIN41 war bereits
beschrieben, dass es in pluripotenten Zellen ARGONAUTE2 (das Mediatorprotein
für microRNA-Funktion) für proteasomalen Abbau markiert und dadurch zu
verringerter microRNA Aktivität führte. Während der Differenzierung wird nicht
nur die Transkription von Lin41 verringert, auch bereits bestehende Lin41 mRNA
wird durch let-7 (eine differenzierungs-assoziierte microRNA) reprimiert.
Homozygote Tiere des Lin41 “gene trap knockout“ Mausmodells sind nicht
überlebensfähig und sterben in der Embryonalphase. Mäuse, die homozygot für
die Deletion des TRIM2, TRIM3 oder TRIM32 Gens sind, sind hingegen
überlebensfähig; jedoch weisen die Tiere Missbildungen und Fehlfunktionen im
Zentralnervensystem auf. Ziel der hier vorliegenden Doktorarbeit war es
herauszufinden ob TRIM-NHL Proteine generell ähnliche Funktionen ausführen
können. Es wurde untersucht ob TRIM32 und LIN41 mit MYOSIN Va interagieren (so
wie TRIM2 und TRIM3) und ob LIN41, wie TRIM3, den Transport von Endosomen
steuert. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, deuten
darauf hin, dass LIN41 und TRIM32 MYOSIN Va binden, aber LIN41 den endosomalen
Transport nicht reguliert. Weiterhin war von Interesse ob der Verlust von
LIN41 Auswirkung auf die Pluripotenz der Zellen hat und ob die gesamte TRIM-
NHL Familie in der Lage ist die Aktivität von microRNAs zu regulieren. Die
Ergebnisse zeigen, dass der LIN41-Verlust nur indirekte Auswirkung auf
Pluripotenzfaktoren hat und dass TRIM32, nicht aber TRIM2 oder TRIM3, in der
Lage ist die LIN41-Funktion im microRNA Sensorversuch zu übernehmen. Der Fokus
der vorliegenden Arbeit lag auf einer potentiellen Wechselwirkung der TRIM-NHL
Proteine untereinander in den frühen Phasen der Nerven-systementwicklung im
Säugetier. Im Wurm C. elegans wurde bereits ein genetischer Zusammenhang
zwischen den orthologen Proteinen von TRIM32 und LIN41 gezeigt: eine
zusätzliche Deletion des Trim32 Orthologs kompensierte den Phänotyp der Lin-41
Mutante. Aufgrund dieser genetischen Interaktion sollte in dieser Doktorarbeit
die Möglichkeit einer direkten Interaktion geprüft werden. Mittels
Doppelfärbung transfizierter Zellen konnte gezeigt werden, dass die anderen
drei TRIM-NHL Proteine in den gleichen zytoplasmatischen Aggregaten auffindbar
sind wie LIN41. Färbungen von E11.5 Mausembryonen bestätigten, dass alle vier
TRIM-NHL Protein im Neuroepithel exprimiert werden. Immunfärbungen
verschiedener Stammzelllinien zeigten überrasschenderweise, dass alle TRIM-NHL
Proteine, nicht nur LIN41, in pluripotenten Zellen exprimiert werden. TRIM2,
TRIM3 und TRIM32 befinden sich nicht nur zufällig in denselben Aggregaten wie
LIN41, die Proteine interagieren physikalisch miteinander. Diese Interaktion
konnte sowohl in Überexpressionsversuchen als auch mit Proteinlysaten von
E11.5 Embryoköpfen gezeigt werden. Alle TRIM NHL Proteine sind funktionale E3
Ubiquitinligasen, daher liegen funktionelle Folgen der Interaktion Nahe. Die
Hypothese war, dass LIN41 und TRIM32 (das die exakteste Übereinstimmung im
Lokalisationsexperiment aufwies) sich möglicherweise gegenseitig
ubiquitinieren oder ihre Zielproteinspezifität beeinflussen. In
Übereinstimmung mit dieser Hypothese führte die Induktion von LIN41 in
Stamzellen zu einer verringerten TRIM32 Expression. Eine Analyse des globalen
Ubiquitinierungsprofils von Stammzellen deutet darauf hin, dass TRIM32
Ubiquitinierung tatsächlich von LIN41 hervorgerufen werden kann. TRIM32 hat
einen positiven Einfluss auf die Differenzierung, in dem es
Retinolsäuresignale verstärkt. Somit verhindert LIN41 eventuell eine
frühzeitige Differenzierung von Stammzellen, indem es TRIM32 ubiquitiniert und
dadurch seinen Abbau einleitet. Durch die Untersuchung der TRIM-NHL
Proteinwechselwirkung liefert die hier vorliegende Doktorarbeit neue
Erkenntnisse über die Funktion von LIN41 in der Entwicklung des zentralen
Nervensystems.
de
dc.format.extent
XI, 105 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Molecular Characterization of the RING E3 Ubiquitin Ligase LIN41/TRIM71 in
Early Neurogenesis
dc.contributor.firstReferee
Dr. F. Gregory Wulczyn
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Florian Heyd
dc.date.accepted
2014-07-01
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000097026-0
dc.title.translated
Molekulare Charakterisierung der RING E3 Ubiquitin Ligase LIN41/TRIM71 in der
frühen Neurogenese
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000097026
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000015448
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open access