Equine Herpesvirus Type 1 (EHV-1) pUL56 Promotes Dynamin-dependent Endocytosis and Cooperates with pUL43 for Downregulation of Cell Surface MHC class I

Abstract

As a member of the Alphaherpesvirinae, Equine herpesvirus type 1 (EHV-1) is a prevalent pathogen that causes health risk to horse populations worldwide. To establish persistent infection, EHV-1 has evolved an elegant system to escape from recognition and elimination by host immune responses. Usually in mammalian cells, viral infection is a danger signal and activates antigen presentation mediated by major histocompatibility complex class I (MHC-I). On the cell surface, MHC-I molecules carrying viral antigenic peptides recruit cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which in turn kill the virus-infected cells and thus restrain the systemic circulation of virus. However, we recently found that pUL56, a viral component of EHV-1, functions as a major player to effectively prevent MHC-I presentation on the cell surface in vitro and affect a broad range of immune responses in vivo. These facts invoke a question about the molecular basis of pUL56. Using different pharmacological inhibitors, the endo-lysosomal pathway was determined to be responsible for internalization and degradation of cell surface MHC-I upon EHV-I infection, which concurred with the early expression of pUL56. Further study revealed that dynamin and tyrosine kinase were required for pUL56-induced MHC-I endocytosis, but this endocytic process was not affected by inhibition of clathrin or caveolin-1, which primarily constitutes clathrin- and raft/caveolae-mediated endocytosis pathway, respectively. Moreover, significant restoration of cell surface MHC-I was observed in the presence of the ubiquitin-activating enzyme E1 inhibitor PYR41, suggesting that ubiquitination plays a dominant role in induction of MHC-I downregulation. Apart from MHC-I, pUL56 also triggered reduced expression of other cell surface molecules, including CD46 and CD63. It is noted that pUL56 by itself is unable to induce MHC-I downregulation in transfected cells, indicating that interaction of another viral protein with pUL56 might be required for this process. To search for the elusive pUL56 interactor, we screened a single gene knockout library of EHV-1 mutants and identified pUL43, encoded by ORF17 gene, as a novel protein that modulates antigen presentation by MHC-I. Specifically, downregulation of cell surface MHC-I was significantly attenuated when cells were infected with the virus mutant containing a stop codon in place of ORF17 gene, which highlights the important role of pUL43 in regulating presentation of MHC-I to the cell surface. pUL43 is evolutionarily conserved throughout the Alphaherpesvirinae subfamily and contains 10 putative transmembrane (TM) domains. Despite mild influence on cell-to-cell spread, EHV-1 pUL43 proved dispensable for virus replication and release. Expression of pUL43 was detectable from 2 h post infection (hp.i.) and increased until 8 h p.i.; afterwards, the pUL43 protein was degraded in lysosomes. Indirect immunofluorescence analysis revealed that pUL43 co-localized with the Golgi apparatus and required the TM domains at the C-terminus to maintain the formation of vesicles. Furthermore, deletion of its hydrophilic region at the N-terminus (amino acid residues 3-40) compensated the low levels of surface MHC-I expression in infected cells. Intriguingly, co-transfection of pUL43 and pUL56 dramatically prevented surface retention of MHC-I, which depended on the PPxY motifs in the cytoplasmic domain of pUL56. In summary, this dissertation addressed two major concerns: (i) The mechanism of pUL56, by which EHV-1 infection promotes the internalization of cell surface MHC-I molecules via the dynamin-dependent endocytic pathway; (ii) Identification and characterization of pUL43 as a novel MHC-I modulator that acts in concert with pUL56 for regulation of cell surface MHC-I expression. These findings advance our understanding of the intricate strategy that EHV-1 manipulates to circumvent the CTL-mediated immunity and meanwhile shed light on the possible optimization of vaccines against EHV-1 infection.

Das Equine Herpesvirus Typ 1 (EHV-1), ein Mitglied der Alphaherpesvirinae, ist ein weit verbreitetes Pathogen und stellt ein Risiko für Pferdepopulationen weltweit dar. Um eine persistierende Infektion zu etablieren, bedient sich das Virus eines raffinierten Systems zur Umgehung der zellulären Immunabwehr. Normalerweise lösen Virusinfektionen Gefahrensignale aus, welche zur Antigenpräsentation auf infizierten Zellen durch den Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (major histocompatibility complex class I, MHC-I) führen. Durch die Präsentation antigener viraler Peptide durch MHC-I Moleküle auf der Zelloberfläche werden zytotoxische T-Zellen (cytotoxic T lymphocytes, CTL) rekrutiert. Diese töten Virus-infizierte Zellen ab und verhindern so eine systemische Virusausbreitung. Wie wir kürzlich zeigen konnten, ist das EHV-1-Protein pUL56 ein Hauptakteur in der effektiven Reduktion der MHC-I-Präsentation in vitro was weitreichende Folgen auf die Immunantwort in vivo hat. Diese Fakten werfen Fragen über den molekularen Wirkmechanismus von pUL56 auf. Mit Hilfe von verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren konnte die endo-lysosomale Maschinerie für die Internalisierung und den Abbau der MHC-I-Moleküle auf der Zelloberfläche nach einer EHV-1 Infektion verantwortlich gemacht werden, was auch mit der frühen Expression von pUL56 koinzident war. Weitere Experimente zeigten, dass Dynamin und Tyrosinkinasen für die Endozytose von MHC-I erforderlich sind und dass eine Inhibition von Clathrin (Clathrin-vermittelte Endozytose) oder Caveolin-1 (Caveolae-vermittelte Endozytose) keinen Einfluss auf die Endozytose des MHC-I hat. Außerdem konnte in Anwesenheit von PYR41, einem Inhibitor des Ubiquitin- aktivierenden Enzyms E1, beobachtet werden, dass die Anzahl der MHC-I-Moleküle auf der Zelloberfläche signifikant anstieg. Dies legte nahe, dass die Ubiquitinierung eine wichtige Rolle in der Verminderung von MHC-I auf der Zelloberfläche spielt. Neben MHC-I-Molekülen wurde durch pUL56 auch die Präsenz anderer Moleküle auf der Zelloberfläche reduziert (u.a. CD46, CD63). Wie bereits bekannt ist, ruft pUL56 alleine in Transfektionsexperimenten keine MHC-I-Reduktion hervor, was darauf hindeutete, dass eine Interaktion von pUL56 mit einem anderen viralen Protein für diesen Prozess notwendig ist. Zur Identifizierung dieses unbekannten Interaktionspartners wurde eine EHV-1 Knockout-Bank erstellt und analysiert. Mit pUL43, das durch den offenen Leserahmen (open reading frame, ORF) 17 kodiert ist, wurde ein neues Protein identifiziert, welches die MHC-I-Antigenpräsentation moduliert. Nach Infektion von Zellen mit einer ORF17-Stop-Virusmutante kam es zur signifikanten Abschwächung der Reduktion von MHC-I auf der Zelloberfläche. Dies weist auf eine zentrale Rolle von pUL43 in der Präsentation der MHC-I-Moleküle auf der Zelloberfläche hin. pUL43 ist in allen Alphaherpesvirinae konserviert und enthält 10 mutmaßliche Transmembrandomänen (TM). Obwohl EHV-1 pUL43 die Zell- zu-Zell-Virusausbreitung in geringem Maße beeinflusst, ist es weder essentiell für Virusreplikation noch für Virusfreisetzung. Die Expression von pUL43 war ab 2 Stunden nach Infektion nachweisbar und stieg bis 8 Stunden nach Infektion an. Danach wurde pUL43 durch lysosomale Aktivität degradiert. Mit Hilfe von indirekter Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass pUL43 mit dem Golgi- Apparat kolokalisert und die TM-Domänen am C-Terminus für eine Aufrechterhaltung der Golgi-Vesikel essentiell sind. Außerdem hatte eine Deletion der hydrophilen Region am N-Terminus (Aminosäuren 3 bis 40) eine Kompensation der geringerne Anzahl an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche zur Folge. Interessanterweise verhinderte eine Ko-Transfektion von pUL43 mit pUL56 die Aufrechterhaltung von MHC-I auf der Zelloberfläche größtenteils, bedingt durch die PPxY-Motive des zytoplasmatischen Teils von pUL56. Zusammenfassend adressiert diese Arbeit zwei zentrale Komplexe: (i) den Mechanismus von pUL56, durch den eine EHV-1 Infektion die Internalisierung von MHC-I-Molekülen von der Zelloberfläche via Dynamin-abhängiger Endozytose hervorruft; (ii) die Identifikation und Charakterisierung von pUL43 als neuen MHC-I-Modulator, der zusammen mit pUL56 die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche reguliert. Diese Erkenntnisse führen zu einem besseren Verständnis, wie EHV-1 die durch CTL mediierte Immunantwort manipuliert und zeigen gleichzeitig Möglichkeiten zur Optimierung gängiger EHV-1-Impfstoffe auf.