Untersuchung pharmakodynamischer Biomarker bei Patienten nach einer Nierentransplantation

Abstract

Die Nierentransplantation ist die beste Therapieoption des terminalen Nieren- versagens, da das Überleben verglichen mit Dialyseverfahren länger ist. Die im An-schluss an eine Nierentransplantation notwendige lebenslängliche immunsuppressi-ve Therapie reduziert wegen dosisabhängiger Nebenwirkungen die Langzeitprogno-se. Die engmaschige Therapieüberwachung mittels pharmakokinetischer Parameter zur Minimierung der Dosis lässt jedoch keine Rückschlüsse auf die Wirkung der Im-munsuppressiva im Individuum zu, sodass Nebenwirkungen und Abstoßungen den-noch auftreten können. Dieser Rückschluss soll durch die Messung immunologischer Funktionen durch pharmakodynamische Parameter (Biomarker) ermöglicht werden. In dieser Studie wurden de novo Nierentransplantierte nach Basiliximab-Induktion mit einer Dreifach- Immunsuppression aus Cyclosporin, Mycophenolat-Natrium und Me-thylprednisolon behandelt. Nach Randomisation an Tag 135 nach Transplantation wurde die eine Hälfte der Patienten von Cyclosporin auf Everolimus unter Beibehal-tung der immunsuppressiven Komedikation umgestellt und die andere Hälfte fortge-führt. Zu unterschiedlichen Messzeitpunkten nach Transplantation ist die Expression der Zytokine Interleukin-2 (IL-2) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) in T-Zellen, der Oberflächenrezeptoren CD25 und CD71 auf T-Zellen und die lymphozytäre Prolifera-tionsrate mittels Durchflusszytometrie (FACS) sowie die Inosinmonophosphatde-hydrogenase(IMPDH)-Aktivität mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) bestimmt worden. Zusätzlich wurden Laborwerte dokumentierte klinische Ereignisse mit den Biomarkern korreliert. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Biomar-kerverlauf nach Transplantation darzustellen, Unterschiede zwischen den Studien-armen zu erkennen. Ferner sollte die Biomarkerexpression zwischen Patienten mit und ohne Nebenwirkung untersucht werden. Zur Detektion der Zytokine bzw. der Oberflächenrezeptoren und lymphozytären Proli-ferationsrate wurde Vollblut mit Ionomycin und 12-Phorbol-13-Myristat-Acetat bzw. Concanavalin A inkubiert. Die entsprechenden Zielstrukturen wurden mit fluores-zenzmarkierten Antikörpern (CD3, IL-2, TNF-α, CD25, CD71, Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen und Propidium-Iodid) gefärbt. Abschließend wurde im FACS der An-teil biomarkerexprimierender Zellen bestimmt. Zur Bestimmung der IMPDH-Aktivität wurden periphere mononukleäre Zellen isoliert. Die Zellen wurden lysiert und mit ei-nem Inkubationspuffer bestehend aus Inosinmonophoshat, Nikotinamid- Adenin-Dinukleotid, Natriumhydrogencarbonat und Kaliumhydrogenphosphat inkubiert. Nach Beendigung mit Perchlorsäure erfolgte die Konzentrationsmessung von Xanthosin-monophosphat und Adenosinmonophosphat mittels HPLC. Die Messwerte wurden in Relation zum Ausgangswert vor Transplantation gesetzt. Alle Biomarker werden initial stark gehemmt. Die maximale Hemmung der IL-2- und TNF-α-, CD25- und CD71-Expression und lymphozytären Proliferationsrate beträgt 34%, 35%, 6%, 21% und 6% des Ausgangswertes. Die IMPDH-Aktivität wird unmit-telbar nach der Transplantation halbiert. Nach der Randomisation bleibt die IMPDH-Aktivität in der Cyclosporin-Gruppe konstant und reduziert sich in der Everolimus-Gruppe weiter. Die Expressionen von IL-2, TNF-α und CD25 zeigen keine Unter-schiede zwischen den Studienarmen. Die CD71-Expression ist im Everolimus-Arm niedriger als im Cyclosporin-Arm. Die lymphozytäre Proliferationsrate ist im Everoli- mus-Arm tendenziell niedriger als im Cyclosporin-Arm. Die IL-2- und TNF-α-Expression korreliert ebenso wie die Expression von CD25 mit CD71 bzw. der Proli-ferationsrate und die CD71-Expression mit der Proliferationsrate. Die Proliferationsra-te und die CD25- bzw. CD71-Expression korrelieren mit der Prednisolon-Dosis und der Mycophenolsäure-Talspiegelkonzentration im cyclosporinhaltigen Regime. Der Kreatininwert in der Everolimus-Gruppe war niedriger als in der Cyclosporin-Gruppe. Die häufigste Nebenwirkung war eine Nierenfunktionsstörung gefolgt von Diarrhö und Wundheilungsstörung, Anämie, Leukopenie und Proteinurie. Die CD25-Expression war bei Patienten mit später eintretender Anämie vermindert. Eine Leukopenie zeigte zuvor eine verminderte IMPDH-Aktivität und IL-2- sowie erhöhte TNF-α-Expression. Die Diarrhö zeigte vor dem Auftreten eine erhöhte IL-2- und TNF-α-Expression sowie eine verminderte CD71-Expression und IMPDH-Aktivität. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Messung von Biomarkern eine immunsuppres-sive Therapie abbilden kann. Die Effekte der einzelnen Immunsuppressiva werden je nach gemessenem Biomarker über den Zeitraum eines Jahres nach Transplantation deutlich. Zukünftige Studien sollten die Eignung der Biomarker zur Steuerung der immunsuppressiven Therapie untersuchen und individuell geeignete immunsuppres-sive Kombinationen finden, um das Langzeitüberleben und die Therapieeffektivität weiter zu steigern. Weiterhin sollte untersucht werden, ob sich die Biomarker auch zur Detektion von Nebenwirkungen vor der klinischen Manifestation eignen und diese so zu verhindern.

Renal transplantation is the first choice in the treatment of endstage renal disease, because it improves long-term survival more than dialysis. The immunosuppression required subsequently impairs that effect due to enclosed dose-related side effects. A close therapeutic drug monitoring using pharmacokinetic parameters to minimize drug dosing allows no conclusion to be drawn about the drug’s effect in the individual patient, thus there are people having side effects or rejection episodes. An approach to fill that gap is measuring immunological functions from pharmacodynamic parame-ters (biomarkers). In this study de novo renal transplanted patients were treated with a triple immuno-suppressive regimen with cyclosporine, enteric coated mycophenolate-sodium and methylprednisolone following an induction with basiliximab. At day 135 one part of the study group was randomized from cyclosporine to everolimus leaving the con-comitant immunosuppression unchanged. On different days after transplantation we detected intracellular cytokine expression in T-cells (Interleukin-2 and Tumornecro-sisfactor-α), surface activation marker expression on T-cells (CD25 and CD71) and lymphocyte proliferation using flow cytometry. Activity of inosine monophosphate de- hydrogenase (IMPDH) was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC). Laboratory values and adverse events were correlated with the biomarkers. The aim of this study was to investigate the biomarker’s course after transplantation and differences between the two therapies. Differences in biomarker expression be-tween patients with and without adverse events were also to be investigated. Whole blood was incubated with ionomycine and 12-phorbol-13-myristate-acetate or concanavaline A for detection of cytokines or surface activation markers and lympho-cyte proliferation rate, respectively. The targets were stained with fluorescent-marked antibodies (CD3, IL-2, TNF-α, CD25, CD71, proliferating cell nuclear antigen and propidium iodide). The amont of biomarker positive cells was counted in the cytome-ter. For IMPDH-activity-measurement peripheral blood mononuclear cells were isolated. The sample was lysed and incubated with a buffer containing nicotinamide-adenine-dinucleotide, sodium dihydrogene carbonate and potassium hydrogene phosphate. After termination with perchloric acid the concentrations of xanthosine and adenosine monophosphate were measured with HPLC. The results were normalized to the initial biomarker value. All biomarkers were markedly inhibited after transplantation. The maximum inhibition of IL-2-, TNF-α-, CD25- und CD71-expression and lymphocyte proliferation rate was 34%, 35%, 6%, 21% and 6%, respectively. IMPDH-activity was reduced by half. After randomization it remained unchanged in the cyclosporine group whereas it was re-duced further in the everolimus group. The IL-2-, TNF-α- and CD25-expression showed no significant differences between the study groups. The CD71-expression was smaller in the everolimus group than in the cyclosporine group. The lymphocyte proliferation rate tended to be smaller in the everolimus group than in the cyc-losporine group. The expressions of IL-2 and TNF-α, CD25 and CD71, CD25 and the proliferation rate and CD71 and the proliferation rate correlated. The proliferation rate, CD25- and CD71-expression correlate with the dose of methylprednisolone and trough level of mycophenolic acid in the cyclosporine group. The creatinine level was lower in the everolimus group compared with the cyclosporine group. Most common adverse event was renal dysfunction, followed by diarrhea, wound healing disorder, anemia, leukopenia and proteinuria. CD25-expression was reduced in patients with consequent anemia. Patients suffering from leukopenia showed a smaller IMPDH-activity and a higher IL-2- and TNF-α-expression. Higher IL-2- and TNF-α-expressions and smaller CD71-expression and IMPDH-activity were observed in pa-tients with consequent diarrhea. This study shows that the course of biomarkers is influenced by the immunosuppres-sive therapy. Synergistic effects of immunosuppressive combinations are reflected as well as changes in the course of a one-year period after transplantation. Future stud- ies should investigate the biomarker’s use to monitor an immunosuppressive therapy in order to find appropriate regimens for the individual patient and to minimize side effects. Another interesting aspect to investigate the biomarker’s benefit is to detect adverse events before their clinical manifestation and thus help avoiding them.