Untersuchungen molekularer Mechanismen des Übergangs von Rindereizellen zu Embryonen: Prozesse der Translationsregulation – Interaktion zwischen dem 5´Initiationskomplex der Translation und 3´-Poly(A)-Bindungsproteinen während der meiotischen Endreifung und der frühen Embryonalentwicklung beim Rind

Abstract

Die In-Vitro-Produktion (IVP) von Embryonen ist ein Standardverfahren der Tierzucht vor allem beim Rind. Trotzdem liegen die Blastozystenraten bei Oozyten mit morphologisch guter Qualität nur zwischen 30 und 40%. Besonders während der meiotischen Endreifung der Eizellen und der frühen Embryonalentwicklung werden entscheidende Grundlagen für die weitere Entwicklungsfähigkeit des Embryos gelegt. Am Beginn der Eizellendreifung wird durch die Kondensation des Chromatins die Transkription fast vollständig eingestellt. Trotzdem findet sich vermehrt polyadenylierte mRNA, die jedoch kaum translatiert wird. Stattdessen ist in MII-Eizellen die Translation stark reprimiert. Damit kommt es zur Akkumulation translatorisch inaktiver mRNAs, die dem frühen Embryo vor Einsetzen der eigenen Transkription spezifisch aktivierbar zur Verfügung stehen. An diesem Punkt ist eine Regulation nur noch auf der Ebene der Translation möglich. Limitierend für die Proteinsyntheserate und zentraler Ansatzpunkt der Regulation ist dabei die Translationsinitiation. Von Bedeutung sind hierbei vor allem verschiedene Initiationsfaktoren und andere 5´- und 3´- interagierende Proteine und die diese kontrollierenden Kinasen. Es soll bewiesen werden, dass stadienspezifische Veränderungen im Auftreten und der Phosphorylierung dieser Faktoren für die Repression der Translation in MII-Eizellen und deren Reaktivierung im frühen Embryo verantwortlich sind. Die wichtigsten Faktoren wurden im Rahmen dieser Arbeit anhand von in vitro gereiften bovinen Oozyten und Embryonen hinsichtlich ihres Vorkommens und ihrer Phosphorylierung im Verlauf der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung mittels SDS-PAGE, Isoelektrischer Fokussierung, Western Blot und Immunopräzipitation analysiert. Dazu gehörten der eIF4F-Komplex mit dem Cap-Bindungsprotein eIF4E, dem Gerüstprotein eIF4G und der Helikase eIF4A, außerdem der Translationsrepressor 4E-BP1. Zu den 3´-interagierenden Proteinen gehörten PABP1 und 3; Paip1 und 2, CPEB1 und Maskin. Als verantwortliche Kinasen wurden MAPK, Akt und Aurora A und B untersucht. Auf der Grundlage des „Closed Loop“-Modells von Mangus et al. (2003) ergibt sich daraus folgende stark vereinfachte Darstellung der Translationsinitiation: Das Cap- Bindungsprotein eIF4E bindet an die Cap-Struktur am 5´-Ende der mRNA. Durch Aurora A phosphoryliertes Cytoplasmic Polyadenylation Binding Protein CPEB rekrutiert mittels CPSF (cleavage and polyadenylation specifity factor) die Poly(A)-Polymerase, die den Poly(A)-Schwanz verlängert. Daran kann das Poly(A)-Bindungsprotein binden. Die Bildung des eIF4F-Komplexes durch Bindung des Gerüstproteins eIF4G an 4E bringt die RNA-Helikase eIF4A in Position, so dass diese Sekundärstrukturen der mRNA auflösen kann und damit die Bindung des 43SPräinitiationskomplexes ermöglicht. Nur all diese Proteininteraktionen gemeinsam stimulieren die Translation. Dies bietet viele Möglichkeiten der Translationsreprimierung. So kann am 5´- Ende das hypophosphorylierte 4E-BP 1 oder vom 3´- Ende der CPEB-Maskin-Komplex an eIF4E binden und damit über Blockade der Bildung des eIF4F-Komplexes die Helikaseaktivität verhindern. Gerade am Übergang der Eizelle zum Embryo dominieren jedoch spezifische Mechanismen. Es konnte durch unsere Untersuchungen gezeigt werden, dass gerade im Übergang von der MII-Phase zum Zweizellstadium die deutlichsten Veränderungen in Auftreten und Phosphorylierung der beteiligten Faktoren zu finden sind. Darüber hinaus wurde gerade in der MII-Phase die stärkste Phosphorylierung spezifischer Zielsequenzen der Kinasen PKA, PKB, PKC, CDKs, ATM/ATR und MAPK nachgewiesen. Bei der Betrachtung der einzelnen Phasen fällt auf, dass im GV-Stadium die von somatischer Translation bekannten Repressoren wie 4E-BP1 und Paip2 deutlich verringert werden und dafür ein neuer hemmender Faktor in Aktion tritt, der im Verlauf dieser Arbeit entdeckt und erstmals beschrieben wurde. Auf der Suche nach einem dem Repressor Maskin ähnlichen Faktor wurde mittels des Maskin-Antikörpers bei bovinen Eizellen ein Protein gefunden, das zwar mit 55kDa deutlich kleiner ist, aber ebenso eIF4E- Bindungsfähigkeit besitzt und eine „Coiled Coil“-Domäne aufweist. Nur die Bindung mit CPEB konnte nicht nachgewiesen werden. Aber es zeigt sich eindeutig, dass das Protein gerade im GV-Stadium die eIF4EBindung an das Cap blockiert und damit die Bildung des eIF4F-Komplexes reprimiert. Während der weiteren Endreifung findet sich jedoch immer mehr hoch phosphoryliertes Maskin-Like-Protein im Durchlauf, so dass dies nicht die Hauptursache für die Translationsrepression im MII-Stadium sein kann. Eine Verkettung verschiedener Mechanismen verhindert in diesem Stadium die Translationsinitiation. Wichtigstes Element scheint die Degradation von CPEB in diesem Stadium zu sein. Dadurch wird weniger CPSF und folglich auch weniger Poly(A)-Polymeraseaktiviert, die mRNAs werden nicht polyadenyliert. PABP, das insgesamt nur in geringerer Menge in diesem Stadium vorkommt, kann dadurch kaum noch an den kurzen Poly(A)- Schwanz der mRNA binden. Damit steht es nicht für den Ringschluss der mRNA vermittelt durch das Gerüstprotein eIF4G zur Verfügung. Zudem wird eIF4G dephosphoryliert. Gemeinsam mit der fehlenden PABP-Bindung führt dies zu verminderter Affinität zum Cap- Bindungsprotein eIF4E, das zunehmend phosphoryliert wird. Der eIF4F-Komplex kommt damit nur schwach und in geringer Menge zustande, die Aktivität der Helikase eIF4A wird nicht ausgelöst. Damit kann der ribosomale Präinitiationskomplex nicht an die mRNA binden, die Translation unterbleibt. Im frühen Embryo bis zum Vierzeller kehren die Faktoren schrittweise zu einem Status zurück, der den wenigen frühen, nicht CPE-gesteuerten mRNAs die Translation ermöglicht. Die Phosphorylierung von eIF4G steigt wieder an, die des Cap-Bindungsproteins sinkt auf ein mittleres Niveau. Damit wird die Bildung der eIF4F-Komplexe wieder erleichtert. Der Repressor 4E-BP1 weist mittlere Phosphorylierung auf. So ist er noch nicht aktiv, kann aber sehr schnell voll aktiviert werden. Das Maskin-Like-Protein kommt zunächst nur in geringen Mengen vor, steigt dann im Acht- und Sechzehnzeller. In dieser Phase steigt das Vorkommen von CPEB und PABP deutlich an. Dies führt zur Reinitiation auch der Translation der großen Masse CPE-abhängiger mRNAs. In dieser Arbeit konnten Grundzüge der Translationsregulation am Übergang der Eizelle zum Embryo geklärt werden, es bleiben jedoch noch viele Fragen offen. Vor allem die Rolle des Maskin-Like- Proteins, Regulationsmechanismen der Translation früher mRNAs und die unterschiedlichen Gruppierungen der spät translatierten mRNAs bedürfen noch weiterer Untersuchungen.

The In Vitro Production (IVP) of embryos is a standard method in animal husbandry mainly in cattle. Nevertheless, blastocyst rates do not rise above 40% even in morphologically good quality oocytes. Crucial conditions for embryonal viability are established during meiotic maturation of the oocytes and early embryonic development. At the beginning of meiotic maturation the chromatin condensation inhibits the transcription almost completely. Nevertheless, we find an increasing amount of polyadenylated but rarely translated mRNA. In MII-oocytes the translation is strongly repressed. This results in accumulation of polyadenylated, but translational inactive mRNAs, which are available for specific activation to the early embryo before his own transcription starts. At this point regulation is only possible at the level of translation. The limiting step for protein synthesis and central regulation mechanism is the initiation of translation. Here, especially the translation initiation factors, other 5´- and 3´-interacting proteins and their controlling kinases are of importance. We want to proof that statespecific changes in abundance and phosphorylation of 5´ and 3´ binding proteins are responsible for the repression of translation in MII-oocytes and the reactivation in early embryos. In this work the most important factors were analysed with regard to their abundance and phosphorylation state during meiotic maturation and early embryonic development using bovine, in vitro derived oocytes and embryos. Used methods were SDS-PAGE, isoelectric focusing, Western Blot and immunoprecipitation. Analysis included as 5´- interacting factors the eIF4F-complex composed of the cap binding protein eIF4E, the scaffold protein eIF4G and the helicase eIF4A and additionally the translational repressor 4E-BP1. Moreover we analysed PABP1 and 3, Paip1 and 2, CPEB1 and Maskin as 3´-interacting proteins and MAPK, Akt und Aurora A and B as controlling kinases. Based on the Closed Loop-Model by Mangus et al. (2003) it is possible to create the following, strongly simplified model of translation initiation: The cap binding protein eIF4E binds the cap structure at the 5´ end of the mRNA. Following its phosphorylation by Aurora A, the cytoplasmic polyadenylaton binding protein CPEB recruits CPSF (cleavage and polyadenylation specifity factor) that activates the poly(A)-polymerase (PAP), which elongates the poly(A)-tail. This gives the Poly(A)-Binding Protein PABP the possibility to bind. The formation of the eIF4F-complex with binding of eIF4G to eIF4E brings eIF4A into position to resolve secondary structures and allows the binding of the 43S preinitiation complex. Only all of these protein interactions together stimulate the translation. This offers lots of different possibilities to repress translation. The hypophosphorylated 4E-BP1 at the 5´-end and the CPEB-Maskin-complex from the 3´-end can bind to eIF4E and in this way block the formation of the eIF4F-complex and the helicase activity. But especially at the oocyte to embryo transition very specific mechanisms are dominant. Our findings show that especially at the transition from MII-stage to two-cell-embryo the most striking differences in abundance and phosphorylation of the involved factors are to be found. Furthermore, major phosphorylation of specific target sequences of PKA, PKB, PKC, CDKs, ATM/ATR and MAPK was observed in MII stage oocytes. Closer examination of the different stadiums shows that in GV-stage the abundance of translational repressors 4E-BP1 and Paip2 is strongly reduced and a new repressing factor takes their place, which was discovered and described for the first time during this research. Looking for a Maskin related factor using a Maskin antibody we found a 55kDa protein, which is much smaller, but has eIF4E binding ability and possesses a coiled coil domain. Only a binding to CPEB could not be verified. However it was clearly shown that especially in GVstage the Maskin like protein blocks eIF4E-binding to the Cap and the formation of the eIF4Fcomplex. But during further meiotic maturation the Maskin like protein is phosphorylated and lots of it can be found in supernatant. So it can’t be the most responsible factor for translational repression in MII- oocytes. Interlinking of different mechanisms seems to be the real cause. The most important part is the degradation of CPEB in this stage. Due to this there is no activation of CPSF and Poly(A)- Polymerase, mRNAs do not become polyadenylated, the additionally reduced PABP is less likely to bind to the shortened Poly(A) tail. As a consequence it is not available for the closure of the mRNA ring. Missing PABP-binding and dephosphorylation of eIF4G strongly reduce its binding affinity to eIF4E, which becomes even more phosphorylated during maturation. Formation of the eIF4F-complex is inhibited, such as the activity of eIF4A. Consequently the ribosomal translation initiation complex can’t bind to the mRNA, therefore translation is repressed. In the early embryo until four cell stage the factors gradually return to a state, which facilitates translation of some early, not CPE-controlled mRNAs. Phosphorylation of eIF4G rises, that of eIF4E decreases to a middle level. Both simplify the formation of eIF4F. The repressor protein 4E-BP1 shows a middle phosphorylation state. So it is not active, but easily and promptly to activate. The maskin like protein can be found in a minor amount in early stages, its abundance rises slowly in eight and sixteen cell stage. At this time the expression of CPEB and PABP increases strongly. This causes reinitiation of translation of the big amount CPE-dependent mRNAs. In this work basic structures of translation regulation at the oocyte to embryo transition could be explained, but there are lots of questions remaining. Especially the role of Maskin like protein, regulatory mechanisms for the translation of early mRNAs and the different subtypes of late translated mRNAs need to be further investigated.