The biotechnological potential for manipulating offspring sex in the rhinoceros and the elephant

Abstract

All extant rhinoceros and elephant species are endangered in the wild; yet urgently needed captive breeding to stabilise world populations of some species turns out to be a substantial challenge. One key issue in captive breeding is the unwanted high proportion of male offspring, a serious problem particularly in very small populations. If manipulating offspring sex was a feasible, successful and safe option, a higher number of females could be produced. This would accelerate population growth, thereby significantly improving the viability of populations and thus the conservation of these impressive animals. The ability to select sex would be especially useful in species close to extinction such as the northern white rhinoceros (Ceratotherium simum cottoni) with only two remaining female breeding candidates, worldwide. To date, the only reliable method to select offspring sex is the Beltsville sperm-sorting technology in combination with artificial insemination (AI) or in vitro fertilisation (IVF). This technique is based on flow cytometric separation of X and Ychromosome bearing spermatozoa in relation to their DNA content. The aim of this study was to determine the feasibility of spermatozoa from elephants and rhinoceroses for flow cytometrical sex-sorting and to conduct basic investigations on sperm sex- sorting in these megaherbivores by exploring and establishing species-specific sorting conditions. First, the theoretical sortability of the spermatozoa was established through determination of the sperm sorting index (SSI). This index is calculated by multiplying the difference in relative DNA content between X and Y- chromosome bearing spermatozoa (as calculated by the flow cytometer) with the profile area of the sperm head. The resulting SSI values indicated that spermatozoa from the African savannah elephant (Loxodonta africana) deliver best preconditions for successful sex-sorting in the flow cytometer, followed by those of the Asian elephant (Elephas maximus). The general sortability of spermatozoa from the examined rhinoceros species [black (Diceros bicornis), white (Ceratotherium simum) and Indian rhino (Rhinoceros unicornis] was shown to be very similar among each other and lower when compared to the elephant species or to livestock. Second, basic parameters for flow cytometric sex-sorting of spermatozoa from the black and the white rhinoceros and the Asian elephant were determined. Species-specific semen extenders, suitable for sex-sorting, and an appropriate DNA staining protocol (suitable amount of stain, incubation time and temperature) were developed. Sperm sex-sorting of rhinoceros spermatozoa thereby turned out to be challenging. Using the methods developed here, successful sex-sorting spermatozoa into specific X and Y- chromosome bearing populations produced high purity (94 %) but the sperm quality after sorting (sperm integrity: 42.0 ± 5.4 %; sperm motility: 11.5 ± 6.1 %) and the sorting efficiency (300 – 700 sperm/s) are still low. The high viscosity of rhinoceros ejaculates strongly interferes with DNA staining and sorting. The main component of the viscous fraction, a glycosilated protein with a molecular weight of 250 kDa molecular weight (most likely originating from the bulbourethral gland), was characterised via gel electophoresis and mass spectrometry. Investigating the liquefaction of the seminal plasma, the addition of the enzymes α-amylase and collagenase was shown to significantly decrease the viscosity without affecting sperm motility or integrity. In initial trials of enzyme addition to rhinoceros sperm samples that were too viscous for a processing by the flow cytometer, viscosity was reduced sufficiently enough to sort, indicating that enzyme treatment might allow better use of rhino ejaculates for sex-sorting. The sex-sorting protocol developed for the Asian elephant provided very good results for post-sorting sperm quality (sperm integrity: 64.8 ± 3.2 %; motility: 70.8 ± 4.4 %) and purity (94.5 ± 0.7 %) and a reasonable sorting efficiency (1,945.5 ± 187.5 sperm/s). A successful protocol for cryopreservation of Asian elephant spermatozoa was also developed (post-thaw sperm integrity: 52.0 ± 5.8 %) by optimising the cryopreservation protocol (sperm handling pre- and post-cryopreservation, composition of cryomedium) and employing the directional freezing technology. Best post-thaw sperm quality was achieved using a two-step dilution of freshly collected and centrifuged spermatozoa in Blottner’s Cryomedia (285 mOsmol/kg) containing 16 % of egg yolk and a final glycerol concentration of 7 % before freezing. Spermatozoa were slowly cooled to 4 – 5°C and cryop reserved in large volumes of 2.5 or 8 ml at a concentration of 150 x 106 sperm/ml. In the Asian elephant, the results of these studies have already permitted the use of sexsorted spermatozoa for AI. The sorting protocol appears to be technically reliable. However, AI using sex-sorted Asian elephant sperm has not yet produced any gestation. Regarding all the rhinoceros species, the poor post-sort sperm motility and integrity as well as the sorting efficiency have not yet enabled the application of sex-sorted spermatozoa to be used for AI at present, but their use in IVF may still be feasible. This is the first study to explore the potential of flow cytometric sex-sorting of spermatozoa from several species of rhinoceroses and elephants. In terms of its practical value, the developed protocols are ready to be applied in elephants, whereas in the rhinoceros species further research is likely to be required. The results demonstrate the potential of the developed techniques and provide a promising base for the future use of the technology in the conservation management of the endangered megaherbivores.

Alle Nashorn- und Elefantenarten sind vom Aussterben bedroht und die dringend erforderliche Nachzucht in Menschenhand gestaltet sich schwierig. Ein Hauptproblem der Zuchtprogramme ist der ungewollt hohe Anteil männlichen Nachwuchses, der vor allem in kleinen Populationen ein ernsthaftes Problem darstellt. Eine erfolgreiche und sichere Methode zur Manipulation des Nachkommengeschlechts würde die vermehrte Nachzucht weiblicher Tiere und ein beschleunigtes Populationswachstum ermöglichen. Dadurch könnte die Lebensfähigkeit von Populationen signifikant gesteigert werden und somit auch die Chance auf Erhaltung der imposanten Tiere. Dies gilt insbesondere für hochbedrohte Arten, wie das nördliche Breitmaulnashorn (Ceratotherium simum cottoni) mit nur noch zwei verbliebenen weiblichen Zuchttieren, weltweit. Bis heute stellt die Beltsville sperm-sorting Technologie in Kombination mit künstlicher Besamung (KB) oder in vitro Fertilisation (IVF) die einzige verlässliche Methode zur Geschlechtbeeinflussung der Nachzucht dar. Diese Technik basiert auf der flowzytomterischen Trennung von X- und Y- Chromosomen tragenden Spermien anhand ihres Unterschiedes im relativen DNS-Gehalt. Das Ziel dieser Arbeit war es die Eignung von Nashorn- und Elefantenspermien zur geschlechtsspezifischen Spermientrennung im Flowzytometer zu bestimmen und grundlegende Untersuchungen zur Spermien-Sortierung bei diesen Megaherbivoren durchzuführen. Speziesspezifische Sortierbedingungen sollten erforscht und erarbeitet werden. Zunächst wurde die theoretische Sortiereignung der Spermien durch Bestimmung des Spermien-Sortierindexes (SSI) ermittelt. Dieser errechnet sich durch Multiplikation des im Flowzytometer bestimmten Unterschiedes im relativen DNS-Gehalt zwischen X- und YChromsomen tragenden Spermien mit der Spermienkopffläche. Demnach bringen die Spermien vom afrikanischen Savannen Elefant (Loxodonta africana) die besten Vorrausetzungen für eine erfolgreiche flowzyometrische Trennung in X- und YChromosomen tragende Populationen mit, gefolgt vom asiatischen Elefanten (Elephas maximus). Die generelle Sortiereignung von Spermien der drei untersuchten Nashornarten [Breitmaulnashorn (Ceratotherium simum), Spitzmaulnashorn (Diceros bicornis) und Panzernashorn (Rhinoceros unicornis)] erwies sich als untereinander sehr ähnlich und als geringer im Vergleich mit Elefant sowie Nutz- und Haustierarten. Weiterhin wurden elementare Parameter zur flowzytometrischen Sortierung von Breit- und Spitzmaulnashornspermien sowie von Spermien des asiatischen Elefanten bestimmt. Für den Sortiervorgang geeignete speziesspezifische Verdünnermedien wurden entwickelt und ein für die jeweilige Tierart passendes DNS-Färbeprotokoll (Farbmenge, Inkubationszeit und -temperatur) erstellt. Die geschlechtsspezifische Sortierung von Nashornspermien erwies sich als problematisch.Zwar konnten die Gameten erfolgreich und mit hoher Reinheit (94 %) getrennt werden, die Spermienqualität nach Sortieren (Spermienintegrität: 42.0 ± 5.4 %; Spermienmotilität: 11.5 ± 6.1 %) sowie die Sortiereffizienz (300 – 700 Spermien/Sek) waren jedoch noch gering. DNSFärbung und Sortiervorgang der Nashornspermien werden in hohem Maße durch die hohe Viskosität der Ejakulate beeinträchtigt. Als Hauptkomponente der störenden viskösen Fraktion wurde mittels Proteinanalyse von Nashornseminalplasma (via Gelektrophorese und Massenspektrometrie), ein 250 kDa schweres glykosiliertes Protein charakterisiert, das sehr wahrscheinlich aus der Bulbourethraldrüse stammt. Durch Untersuchungen zu einer möglichen Verflüssigung des Seminalplasmas wurde eine viskositätssenkende Wirkung durch Zusatz der Enzyme α-Amylase und Collagenase zu den Spermienproben festgestellt, ohne dass die Spermienmotilität oder deren Integrität negativ beeinflusst wurden. Vorläufige Ergebnisse von Enzymanwendungen zur Viskositätsminderung von Nashornejakulaten zeigten eine positive Wirkung auf deren Sortierbarkeit, was eine zukünftige Steigerung der Sortiereffizienz durch einen routinemäßigen Enzymzusatz erhoffen lässt. Beim asiatischen Elefanten konnten mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Sortierprotokolls sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der Spermienqualität (Spermienintegrität nach Sortieren: 64,8 ± 3,2 %; Spermienmotilität: 70,8 ± 4,4 %) und Reinheit (94,5 ± 0,7 %) nach Trennung in eine X- und eine Y- Chromosomen tragende Population und der akzeptablen Sortiereffizienz (1945,5 ± 187,5 Spermien/Sek) erzielt werden. Parallel dazu wurde, durch Optimisierung des Spermien-Handlings vor und nach Kryokonservierung, der Zusammensetzung des Kryomediums und der Anwendung des direktionalen Gefrierverfahrens, ein erfolgreiches Protokoll zur Kryokonservierung der Spermien vom asiatischen Elefanten entwickelt (Spermienmotilität nach Auftauen: 58,5 ± 6,0 %). Die beste Spermienqualität nach Kryokonservierung wurde durch eine zweistufige Verdünnung der frisch gewonnenen und zentrifugierten Spermien in Blottner’s Kryomedium (285 mOsmol/kg) erzielt, das 16 % Eigelb und eine Endkonzentration von 7 % Glyzerol enthielt. Die Spermien wurden langsam auf 4 – 5°C gekühlt und in großen Vo lumina von 2.5 oder 8 ml bei einer Konzentration von 150 x 106 Spermien/ml kryokonserviert. Beim asiatischen Elefanten erlauben die Ergebnisse dieser Studie schon heute den Einsatz sortierter Spermien in der KB. Das Sortierprotokoll erscheint technisch verlässlich, auch wenn bis jetzt noch keine Trächtigkeit erzielt werden konnte. Beim Nashorn ermöglichen die momentane Sortiereffizienz sowie die Integrität und Motilität der sortierten Spermien zwar anders als beim Elefant noch keinen Einsatz in Besamungen, wohl aber die Verwendung in Methoden der in vitro Embryoproduktion. Diese Arbeit untersucht zum ersten Mal das Potential der geschlechtsspezifischen, flowzytometrischen Spermientrennung von mehreren Nashorn- und Elefantenarten. Hinsichtlich der praktischen Anwendbarkeit sind die entwickelten Protokolle beim Elefanten einsatzbereit, wobei beim Nashorn noch weitere Forschungsarbeit von Nöten ist. Die erzielten Ergebnisse zeigen die Möglichkeiten der entwickelten Methoden auf und bieten eine viel versprechende Basis für die zukünftige Anwendung der Technologie im Erhaltungszuchtmanagement der bedrohten Tierarten.