Microglia in pathological neovascularization in the retina

Abstract

INTRODUCTION. Mononuclear phagocytes (e.g. microglia, macrophages) have been characterized as potential mediators of retinal neovascularization and degeneration. In vivo assessments of mononuclear phagocyte behavior in animals provides an important insight into disease that improves the understanding of pathological mechanisms and helps to approach new therapy developments. Conventional scanning laser ophthalmoscope (SLO), a widely used clinical tool, also permits to track GFP-positive mononuclear phagocytes in specific transgenic animal models. In this work we validate conventional SLO imaging as a tool capable to characterize the spatial- and time-dependent course of mononuclear phagocyte activation in MacGreen mice undergoing laser-induced choroidal neovascularization (CNV). This is a standardized experimental procedure to mimic the neovascularization that occurs in wet age-related macular degeneration. METHODS. Using argon laser, CNV was induced in MacGreen mice. Transgenic MacGreen mice harbor a myeloid-promotor driven GFP-expression that allows monitoring of mononuclear phagocytes in vivo by means of fundus auto-fluorescence in SLO. Data was verified ex vivo using retinal flat-mount preparations or sagittal sections. RESULTS. Mononuclear phagocytes were characterized in different morphological subsets regarding their activation state (e.g. round shape as activated state, ramified processes as surveying) and detected in the inner and outer plexiform layers of the retina. In vivo imaging permitted to quantify spatial and temporal distribution of activated and surveying GFP-positive cells during a time-course after CNV induction. The maximum number of activated cells was detected at day 4 after laser treatment in the inner plexiform layer. Immediately after laser, no acute activation was detected. Furthermore, the spatial distribution of the activation changed by the time in the inner retina. Significant time and spatial changes were not shown in the outer layer. When doubling the laser power impact, the number of activated GFP-positive cells was not significantly increased. CONCLUSIONS. Thus conventional SLO proves to be suitable for an in vivo read-out and quantification of mononuclear phagocyte activation. Data showed that laser damage at the outer retina led to more mononuclear phagocyte activity in the inner retina independent of laser power. Findings regarding the spatial distribution of activated cells unveil a new perspective in the understanding of the cellular immune response in the retina in vivo. After this methodological evaluation, we are currently exploring the same model by hypothesis-driven interventional studies (e.g. intravitreal injections treatment) or in other retinal disease conditions such as oxygen-induced retinopathy, which emulates pre-retinal neovascularization, and streptozotocin-induced type 1 diabetes, as a model for experimental diabetic retinopathy.

EINLEITUNG. Mononukleäre Phagozyten (z.B. Microglia, Macrophagen) wurden als mögliche Vermittler von retinaler Gefäßneubildung und Degeneration identifiziert. Tierexperimentelle Krankheitsmodelle ergeben zusammen mit in vivo Untersuchungen wichtige Einblicke in korrespondierende Erkrankungen und sind im besonderen Maße wertvoll sowohl für die Entwicklung von Therapien als auch für das Verständnis zu Grunde liegender Pathomechanismen. Konventionelle Scanning Laser Ophthalmoskopie (SLO), eine in der Klinik weit verbreitete Methode, erlaubt es auch GFP-positive mononukleäre Phagozyten in bestimmten transgenen Tieren zu detektieren. In dieser Doktorarbeit validieren wir in vivo Bildgebung mittels konventioneller SLO als adäquates Verfahren, den räumlichen und zeitlichen Verlauf der Aktivierung mononukleärer Phagozyten in MacGreen Mäusen nach Laser induzierter chorioidaler Neovaskularisation (CNV) darzustellen. Dabei handelt es sich um ein standardisiertes experimentelles Vorgehen um Neovaskularisation bei feuchter altersbedingter Makuladegeneration zu simulieren. METHODEN. CNV wurde in MacGreen Mäusen mittels Argonlaser induziert. Transgene MacGreen Mäuse zeigen eine für myeloische Zellen spezifische GFP Expression, welche die Beobachtung mononukleärer Phagozyten in vivo mittels Fundusautofluoreszenz ermöglicht. Die in vivo Daten wurden ex vivo in retinalen Flachpräparaten und Sagittalschnitten verifiziert. ERGEBNISSE. Mononukleäre Phagozyten wurden hinsichtlich ihres Aktivierungsgrades in morphologische Gruppen unterteilt (z.B. runde Form als aktivierter Zustand, Form mit ramifizierten Fortsätzen als „überwachende“ Form) und in der inneren und äußeren Retina delektiert. Die in vivo Bildgebung erlaubte die räumliche und zeitliche Verteilung der aktivierten und „überwachenden“ GFP-positiven Zellen nach der Laser-Behandlung zu quantifizieren. Das Maximum aktivierter Zellen wurde an Tag 4 nach Laser in der inneren plexiformen Schicht delektiert. Es kam zu keiner akuten Aktivierung direkt nach der Laserintervention. Des Weiteren veränderte sich die räumliche Verteilung der Zellaktivierung in der inneren Retina über die Zeit. In der äußeren Schicht kam es zu keinerlei signifikanten Veränderungen. Eine Verdopplung der Laserleistung führte nicht zu einem signifikanten Anstieg aktivierter GFP-positiver Zellen. SCHLUSSFOLGERUNG. Somit ist konventionelles SLO geeignet für die in vivo Quantifizierung der Aktivierungsmuster mononukleärer Phagozyten. Unsere Daten zeigen, dass der Schaden durch den Laser in der äußeren Retina zu vermehrter Aktivierung mononukleärer Phagozyten in der inneren Retina führte, unabhängig von der Laserleistung. Des Weiteren wird eine neue Perspektive auf das Verständnis der Immunantwort in der Retina in vivo eröffnet. Nach dieser methodischen Evaluation untersuchen wir zur Zeit am selben Modell Hypothesen-getriebene interventionelle Ansätze (z.B. intravitreale Injektionen) im Zusammenhang mit anderen gefäßspezifischen und/oder neurodegenerativen Entitäten, wie z.B. Sauerstoff induzierter Retinopathie, welche präretinale Neovaskularisation simuliert, oder Streptozotocin induzierter Typ 1 Diabetes als experimentelles Modell für diabetische Retinopathie.