Komplementaktivierung in der Sehne: Wirkung des Anaphylatoxins C3a und des in-vitro Sehnenverletzungsmodells auf Tendozyten vor dem Hintergrund der Sehnenheilung

Abstract

Einleitung: Humane Sehnen müssen hohen mechanischen Beanspruchungen standhalten und weisen einen hyporegeneratorischen Stoffwechsel auf. Die Regulation von Komplementfaktoren und Zytokinen durch Anaphylatoxine ist im Sehnengewebe bislang unklar, könnte aber auf die Sehnenheilung und Narbenbildung Einfluss nehmen. Ziel dieser Arbeit ist es gewesen, den Einfluss der Aktivierung des Komplementsystems durch die Effekte des Anaphylatoxins C3a und durch eine direkte Verletzung von Tendozyten im in-vitro Sehnenverletzungsmodell (IVM) auf Tendozyten zu untersuchen. Methodik: Für die Analysen wurden primäre humane Tendozyten mit dem Anaphylatoxin C3a und dem in dieser Arbeit entwickelten IVM behandelt. Es wurde eine RTD-PCR-Analyse der Genexpressionsveränderungen der Komplementrezeptoren C3aR (CD88), C5aR, der Matrix-Metalloprotease (MMP)-1, der Komplement regulatorischen Proteine (CRP) CD46, CD55 sowie der proinflammatorischen Zytokine TNFα, IL-1β und IL-6 in mit C3a und IVM stimulierten Tendozyten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen durchgeführt, n=4 für C3a, n=5 für IVM. Immunhistologische Färbungen ermöglichten eine semiquantitative Auswertung der Expression von C5aR, CD55, TNFα und MMP-1. Statistik: students t-test, Signifikanzniveau p<0,05. Ergebnisse: Für den C3aR und C5aR konnte nach C3a-Stimulation eine Genexpressionsinduktion gezeigt werden. Die CRP CD46 und CD55 sowie die MMP-1 waren in ihrer Genexpression supprimiert. Für die proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β konnte eine Genexpressionsinduktion nachgewiesen werden. Im IVM zeigte sich für den C3aR eine Induktion, während der C5aR im IVM in seiner Expression gehemmt wurde. Die komplementinhibitorischen Proteine CD46 und CD55 zeigten im IVM eine Expressionssteigerung. Auch konnte nachgewiesen werden, dass die Genexpression der MMP-1 durch die Verletzung induziert wurde. Die Immunfluoreszenzfärbungen konnten für den C5aR eine verminderte und für CD55 eine erhöhte Proteinexpression nach Verletzung nachweisen, während nach C3a-Stimulation die Expression von C5aR und TNFα erhöht und von CD55 supprimiert war. Schlussfolgerungen: Die Induktion der Anaphylatoxinrezeptoren C3aR und C5aR durch C3a, für C3aR auch durch das IVM, spricht für eine erhöhte Sensitivität der Tendozyten gegenüber einer Komplementaktvierung. Die Suppression der beiden komplementinhibitorischen Proteine CD46 und CD55 durch C3a kann einen, die Aktivität des Komplementsystems begünstigenden Effekt ausüben. Ferner deutet die Induktion der beiden proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β eine durch C3a ausgelöste proinflammatorische Reaktion der Tendozyten an. Der Anstieg von zytoprotektivem CD46 und CD55 kann bei mechanischen Verletzungen eine Komplementaktivierung sowie die damit einhergehende chemotaktische Anlockung von immunkompetenten Zellen im Sehnengewebe vermindern. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit eine Regulation des Komplementsystems durch Komplementspaltprodukte sowie durch mechanische Verletzungen nachgewiesen werden. Eine Komplementdysregulation oder -aktivierung könnte als Pathomechanismus bei Sehnenerkrankungen und Narbenbildung relevant sein und muss in zukünftigen Studien weiter erforscht werden.

Introduction: Human tendons have to sustain high mechanical stresses and strains and exhibit a typical hyporegenerative metabolism. The regulation of complement factors and cytokines by complement split fragments such as anaphylatoxins is completely unclear in tendons. The aim of this work was to investigate the interplay between the anaphylatoxin C3a, complement regulatory proteins and cytokines, which could be involved in tendon healing and scar formation. Furthermore, the impact of direct mechanical injuries of human tenocytes was characterized using an in-vitro Cell-Injury-System (CIS). Methods: Primary human tenocytes were either treated with recombinant C3a or applied to the developed CIS. RTD-PCR analyses were performed to identify possible changes in gene expression of the anaphylatoxin receptors C3aR, C5aR, the complement regulatory proteins (CRP) CD46, CD55, the matrix metalloprotease MMP-1, the pro-inflammatory cytokines TNFα, IL-1β, and IL-6 of C3a- and CIS-stimulated tenocytes in comparison to untreated controls. Immunohistological staining of tenocytes and paraffin sections of tendons allowed a semiquantitative evaluation of C5aR (CD88), CD55, TNFα and MMP-1. Statistic: students t-test, significance level p<0.05. Results: After stimulation with C3a, the gene expression of the C3aR and C5aR was significantly increased, whereas the expression of CD46, CD55 and MMP-1 was suppressed. For the proinflammatory cytokines TNFα and IL-1β an induction of their gene expression could be observed. In the CIS the C3aR showed an enhanced gene expression, whereas C5aR was inhibited. Interestingly, the CRP CD46 and CD55 as well as MMP-1 displayed an increased gene expression in the CIS. The immunofluorescence staining revealed for the C5aR a reduced and for the CRP CD55 an elevated protein expression after injury in CIS, whereas after C3a stimulation C5aR and TNFα were elevated and CD55 was suppressed. Conclusions: The induction of the anaphylatoxin receptors C3aR and C5aR by C3a, for C3aR also verified in the CIS, suggests an increased sensitivity of the tenocytes towards an activated complement system. Suppression of the complement inhibiting proteins CD46 and CD55 by C3a can probably enhance the complement activity. The elevated gene expression of TNFα and IL-1β could reflect a proinflammatory response of the tenocytes induced by C3a. Induced expression of cytoprotective CD46 and CD55 can possibly reduce an activation of the complement system in injured tendons. In summary, the present work shows a regulation of complement by complement split fragments and in injured cells. Dysregulated or activated complement could be a pathomechanism in tendon scar formation and diseases and needs to be further investigated.