Untersuchungen zur posttranskriptionellen Expressionskontrolle des epithelialen Natrium-Kanals ENaC unter Aldosteron und Vasopressin

Abstract

Der epitheliale Natriumkanal ENaC ist essentiell für die Feinregulation der Na+-Reabsorption im distalen Tubulus und dem Sammelrohr der Niere. Er ist dadurch entscheidend an der Aufrechterhaltung der Natrium- und der Wasser- Homöostase sowie der damit verbundenen Regulation des Blutvolumens und Blutdrucks beteiligt. Die Regulation der Na+- und der Wasser-Reabsorption wird dabei hauptsächlich über die Hormone Aldosteron und Vasopressin angesteuert. Diese sind maßgeblich an der Regulation der Expression der drei Untereinheiten des Kanals, alpha-, beta- und gamma ENaC, sowie deren Assemblierung, Aktivierung und Einbau in die Zellmembran beteiligt. In dieser Arbeit sollte daher die Expression des ENaC im Hinblick auf eine nierenspezifische Wirkung der Hormone Aldosteron und Vasopressin, anhand der kortikalen Sammelrohr Zelllinie mCCDcl1 aus der Maus, auf eine Beteiligung posttranskriptioneller Mechanismen untersucht werden. Hierbei sollte der Schwerpunkt insbesondere auf die Rolle von RNA-bindenden Proteinen gelegt werden. Die Untersuchung der Expression der drei ENaC-Untereinheiten zeigte, dass sowohl transkriptionelle als auch posttranskriptionelle Mechanismen an der Regulation der ENaC Expression unter dem hormonellen Einfluss von Aldosteron und dDAVP beteiligt sind. Die Erhöhung der alpha-, und gamma-ENaC mRNA-Menge unter Aldosteron, sowie die Erhöhung der gamma-ENaC mRNA-Menge unter Aldosteron und dDAVP beruhte dabei auf einem Anstieg der Transkription, da es sogar zu einer leichten Destabilisierung der ENaC-mRNAs unter beiden Hormonen kam. In Bezug auf die alpha- und gamma-ENaC mRNA führten Aldosteron (alpha- und gamma-ENaC) und dDAVP (gamma-ENaC) zu einem Anstieg der Translationseffizienz, was durch Polysomengradienten-Analysen nachgewiesen werden konnte. Diese beruhte bei der gamma-ENaC mRNA auf einer Verlagerung der mRNA aus translationsinaktiven mRNP- Komplexen in die Fraktion der translatierten Polysomen. Die RNA-Bindungs- Proteine (RBPs) und die Bindungs-Motive der gamma-ENaC mRNA wurden daraufhin näher untersucht. Durch eine Sequenz-Analyse konnte ein AU-reiches Element (ARE) in der gamma-ENaC 3’UTR identifiziert werden, wobei durch RNA- Affinitätschromatographie verschiedene AU-reiche Element Bindungs-Proteine (ARE-BPs) wie HuR, AUF1 und TTP als RBPs der gamma-ENaC 3’UTR isoliert werden konnten. Für einige RBPs, darunter HuR, TTP, AUF1 und FMRP konnte eine Kolokalisation in Polysomenfraktionen mit der gamma-ENaC mRNA, sowie eine Hormon-abhängige Veränderung der Assoziation an Polysomen gezeigt werden. Die Koexpression von HuR, TTP und FMRP und Luziferase-Konstrukten mit der gamma- ENaC 3’UTR führten zu einer 3’UTR-abhängigen Induktion der Luziferase- Expression. Die Überexpression einzelner RBPs bewirkte damit einen vergleichbaren Effekt, wie er mit dem Luziferase- gamma-ENaC 3’UTR-Konstrukt unter Stimulation mit Aldosteron oder dDAVP beobachtet werden konnte. UV- Crosslinking-Assays der gamma-ENaC 3’UTR unter der Verwendung von überexprimiertem HuR und RNA-Pulldown-Assays zeigen, dass HuR konzentrationsabhängig mit der gamma-ENaC 3’UTR interagiert und eine vermehrte Komplexbildung von gamma-ENaC mRNA und HuR mit dem Anstieg der Translationseffizienz unter Hormonstimulation einhergeht. Außerdem konnte demonstriert werden, dass eine Überexpression von HuR in mCCDcl1-Zellen ausreichte um die Expression von endogenem gamma-ENaC zu induzieren.

The epithelial sodium channel ENaC is essential for the fine-regulation of the Na+-reabsorption in the distal tubule and the collecting duct of the kidney. ENaC, therefore, plays a major role for the maintenance of sodium- and water- homoeostasis and the associated regulation of blood-volume and pressure. These processes are mainly regulated by the hormones aldosterone and vasopressin (dDAVP). These hormones also regulate the expression, assembly of the three ENaC subunits alpha-, beta- and gamma-ENaC as well as the activation and exposition of functional ENaC channels at the cell membrane. This study aims to investigate the effects of aldosterone and vasopressin on posttranscriptional mechanisms during ENaC expression using the cortical collecting duct mouse cell line mCCDcl1. Within this process I focussed on the role of RNA-binding proteins. The investigation of ENaC subunit expression under the influence of aldosterone and dDAVP showed a participation of both, transcriptional and posttranscriptional mechanisms for the regulation of ENaC expression. It was demonstrated that the increase of alpha- and gamma-ENaC mRNA under the influence of aldosterone, and the increase of the gamma-ENaC mRNA during application of aldosterone and dDAVP are both based on an upregulation of transcription, since ENaC-mRNAs even show a destabilization under the presence of both hormones. Polysome gradient analysis showed an increase in translational efficiency of ENaC subunits under the influence of aldosterone (alpha- and gamma-ENaC) and dDAVP (gamma-ENaC). In case of gamma- ENaC mRNA this increase was based on a translocation of the mRNA from translational inactive mRNP-complexes into the fraction of actively translated polysomes. RNA-binding-proteins (RBPs) and binding motifs of the gamma-ENaC mRNA were then investigated in more detail. By analysis of gamma-ENaC mRNA sequence an AU-rich element (ARE) in the gamma-ENaC 3’UTR was identified. Moreover, different AU-rich element binding proteins (ARE-BPs) such as HuR, AUF1 and TTP could be identified as RBPs of gamma-ENaC 3’UTR by RNA-affinity- chromatography and MALDI-TOF-MS. Some of the RBPs, such as HuR, TTP, AUF1 and FMRP, colocalized with gamma-ENaC mRNA in polysome fractions and showed a hormone-dependent change of their association to polysomes. The coexpression of HuR, TTP, FMRP and luciferase-conjugated gamma-ENaC 3’UTR constructs showed a 3’UTR dependent induction of luciferase expression. Overexpression of single RBPs therefore showed a similar effect as observed for the luciferase- conjugated gamma-ENaC 3’UTR under stimulation with aldosterone or dDAVP. UV- crosslinking-assays of the gamma-ENaC 3’UTR with overexpressed HuR and RNA- pulldown-assays documented a concentration dependence of the interaction between HuR and the gamma-ENaC 3’UTR and that an increase of the interaction between gamma-ENaC mRNA and HuR is correlated with an increase in translational efficiency during hormone stimulation. Moreover an overexpression of HuR in mCCDcl1 cells was sufficient to induce endogenous gamma-ENaC expression.