Expression von caninem IL-4 in E.coli und Säugerzellen (CHO-Zellen/canine Knorpelzellen) sowie Entwicklung eines direkten Sandwich-ELISA zur Messung von caninem Interleukin-4

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, geeignete Zielzellen und Transfektionsmechanismen zu finden sowie eine geeignete Meßmethode für das canine IL-4 zu entwickeln, um in der Zukunft eine Gentherapie mit Interleukin-4 gegen die rheumatoide Arthritis beim Hund einsetzen zu können. Das canine IL-4 wurde in unserem Institut kloniert und in einen Transfektionsvektor für Säugerzellen (pcDNA3.1) einkloniert. Wie aus zahlreichen Studien hervorgeht, eignen sich Knorpelzellen besonders als Zielzellen für eine Transfektion und zur späteren Transplantation in das erkrankte Gelenk. Da eine canine Knorpelzellinie kommerziell nicht zu erhalten war, wurden im Rahmen dieser Arbeit primäre Knorpelzellen vom Hund verwandt. Als Kontrollzellen für die Transfektionen dienten CHO-Zellen. Die Transfektion wurde mit kationischen Lipiden (LipofectAMINE-PLUSTM) durchgeführt, um eine hohe Transfektionseffizienz zu erreichen und gleichzeitig die potentielle Gefahr, die von viralen Vektoren ausgehen kann, auszuschließen. Um die Transfektionseffizienz qualitativ erfassen zu können, wurde das Gen für canines IL-4 ebenfalls in ein GFP- Plasmid mit dem Ziel einkloniert, eine fluoreszensmikroskopische Darstellung der Transfektion zu erhalten. Die Transfektionseffizienz betrug ca. 35%. Zusätzlich wurde die mRNA der transfizierten CHO- und Knorpelzellen mit Hilfe des TriStar-Reagenz gewonnen und mittels RT-PCR nachgewiesen. Um die Expression von IL-4 quantitativ messen zu können, wurde der Doppel-Sandwich- ELISA entwickelt; zur Erreichung einer höheren Sensitivität, wurde das Verstärkersystem Biotin/Streptavidin verwandt. Diese (Nachweisgrenze/Empfindlichkeit) belief sich auf 0,1 ng/ ml = 5 pg Gesamtproteinmenge. Die Messungen des IL-4 im Zellkulturüberstand der transfizierten Knorpelzellen ergab, daß es möglich war, bis zu 260 ng/ml exprimiertes IL-4 von ca. 102 Knorpelzellen zu erhalten. Als nächstes muß nun gezeigt werden, daß die hohe Expressionsrate des IL-4 der transfizierten Knorpelzellen ausreicht, um genügend therapeutische Effekte im erkrankten Gelenk erzielen zu können. Ist dies der Fall, dann ist man damit der Entwicklung einer Gentherapie gegen die rheumatoide Arthritis des Hundes einen großen Schritt näher gekommen. Die Gentherapie stellt in vielen Bereichen ein vielversprechendes Behandlungskonzept dar. Gerade im Bereich der Orthopädie besteht ein großes wissenschaftliches Interesse, diese Behandlungsmethode einzusetzen. Der gezielte Einsatz des antiinflammatorisch wirkenden Zytokins Interleukin-4 bei der Behandlung der rheumatoiden Arthritis ist in zahlreichen Studien der Humanmedizin beschrieben worden.

The aim of this study was to find fitting target cells and transfection mechanisms and to develop a suitable method for the measurement of the canine IL-4, creating a basis for the future use of gene therapy with Interleukin-4 in the treatment of rheumatoid arthritis of dogs. The canine IL-4 was cloned in our institute and encloned in a transfection vector for mammalian cells (pcDNA3.1). Numerous studies proved cartilage cells to be particularly suitable as target cells for a transfection and for a following transplantation into the infected joint. As it was impossible to commercially acquire a canine cartilage cell line, in the context of this study primary canine cartilage cells were used. For the transfection CHO cells were used as reference cells. The transfection was carried out with cationic lipids (LipofectAMINE-PLUSTM). They allowed a high degree of transfection efficiency; at the same time the potential danger, which can originate in viral vectors, could be eliminated. For the qualitative registration of the transfection efficiency the gene for canine IL-4 was also encloned in a GFP plasmide with the aim to achieve a fluorescence-microscopic representation of the transfection. The transfection efficiency amounted to about 35 %. In addition the mRNA of the transfected CHO cells and cartilage cells was gained with the help of the TriStar reagent and proved with RT-PCR. For the quantitative measurement of the expression of IL-4 the double sandwich ELISA was developed. To reach a higher sensitivity the enforcement system Biotin/Streptavidin was applied. The utmost sensitivity degree amounted to 0.1 ng/ml = 5 pg protein mass. The measurements of IL-4 in the supernatant of the transfected cartilage cells showed that it was possible to gain up to 260 ng/ml expressed IL-4 from about 102 cartilage cells. In a further step it will have to be shown that the high expression degree of the IL-4 of the transfected cartilage cells is sufficient to achieve acceptable therapeutic effects in the infected joint. If this can be proven, a decisive step towards the development of a gene therapy against rheumatoid arthritis of the dog will be done. Gene therapy is considered to be a promising concept of treatment in many ranges. A high scientific interest in this method of treatment consists especially in the field of orthopaedics. The specifical use of the cytokine Interleukin-4, which has an anti-inflammatory effect, for the treatment of rheumatoid arthritis of humans is regarded as a promising approach.