Nachweis UV-induzierter Genaktivierung in Säugerzellen mit Hilfe eines stabil in das Genom integrierten GFP-Vektors

Abstract

Um die Vorteile der Cofaktor-unabhangigen Expression von ýGreen Fluorescent Proteiný (GFP) in heterologen Systemen und der Nachweisbarkeit von GFP in lebenden Zellen in der Untersuchung der Wirkungen ultravioletter (UV-) Strahlung auf Saugerzellen zu nutzen, sollte eine stabile Zellinie hergestellt werden, mit deren Hilfe UV-induzierte Genaktivierung in Saugerzellen anhand der grunen Fluoreszenz des Reporterproteins Enhanced GFP (EGFP) gemessen werden kann. Dazu wurden das an Saugerzellen adaptierte EGFP und seine destabilisierte Variante, d2EGFP, auf ihre Einsatzfahigkeit als Reporter fur die Promotoraktivitat in Saugerzellen untersucht. Im Vergeich zu den Ausgangszellinien zeigten stabil transfizierte, konstitutiv EGFP- oder d2EGFP- exprimierende CHO-Zellinien keine Veranderung des Wachstumsverhaltens und der Empfindlichkeit gegenuber Rontgen- und UVC-Strahlung. EGFP konnte in lebenden und Formaldehyd-fixierten Zellen durch FACS-Analyse und im Fluoreszenzmikroskop in jeder einzelnen Zelle, und zeitsparend im MTP- Fluorimeter nachgewiesen werden. Dabei besteht eine lineare Abhangigkeit der Fluoreszenzintensitat von der Anzahl der Zellen. Nach stabiler Transfektion kann das Wachtum dieser Zellen nach Behandlung mit einem zytotoxischen Agens anhand der EGFP-Fluoreszenz im MTP-Fluorimeter gemessen werden. Konstitutiv exprimiertes d2EGFP, das eine Halbwertszeit von 3 h in CHO-Zellen hat, konnte dagegen nur durch FACS-Analyse und im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Zur Untersuchung der UV-induzierbaren Genexpression wurde die stabil transfizierte Zellinie HEK-pNF-kappaB/Neo hergestellt, bei der das Reportergen d2EGFP unter Kontrolle eines synthetischen Promotors steht, der vier NF- kappaB-Bindungsstellen und den minimalen Thymidinkinase-Promotor enthalt. In dieser humanen embryonalen Nierenzellinie kann UVA-induzierte Genaktivierung anhand der d2EGFP-Fluoreszenz gemessen werden. TNF-alpha loste in bis zu 90 % der Zellen dieser Zellinie d2EGFP-Expression aus und wurde deshalb als Positivkontrolle der Induktion NF-kappaB-abhangiger Genexpression verwendet. UVC- und UVB-Strahlung losten keine erhohte d2EGFP-Expression aus, Rontgenstrahlung nur in hohen Dosen. Behandlung mit dem Tumorpromotor PMA verursachte d2EGFP-Expression in bis 40 % der Zellen einer Population. Der Nachweis dieser induzierten d2EGFP-Expression erforderte die FACS-Analyse oder das Betrachten im Fluoreszenzmikroskop, eine Messung im MTP-Fluorimeter war aufgrund der geringen Fluoreszenzintensitat nicht moglich.

In order to benefit from the advantages of the cofactor-independent expression of ýGreen Fluorescent Proteiný (GFP) in heterologous systems and its detection in living cells for the exploration of the effects of ultraviolet (UV) radiation in mammalian cells, a stable cell line was established, by means of which UV induced gene activation can be measured as green fluorescence of the reporter protein ýEnhanced GFPý (EGFP). For this purpose, the suitability of EGFP and its destabilized variant, d2EGFP, as reporter of promoter activity in mammalian cells was examined. By means of stably transfected, constitutively EGFP or d2EGFP expressing CHO cells, different detection methods were tested. Compared to the parental cell lines, these stably transfected cell lines showed no change in growth behaviour and in the sensitivity towards X-rays and UVC radiation. EGFP was either monitored in living and in formaldehyde fixed cells by FACS analysis and in the fluorescence microscope in each individual cell, or by a time- saving procedure using a microplate reader. A linear correlation between fluorescence intensity and cell number per well was found. Using these stably transfected cells, the effect of cytotoxic agents on cell growth can be measured as a reduced EGFP fluorescence increase in the microplate reader. Constitutively expressed d2EGFP, which shows a half-life of 3 h in CHO cells, can only be monitored by FACS analysis and in the fluorescence microscope, but not in the microplate reader. For the examination of UV induced gene expression, the stably transfected cell line HEK-pNF-kappaB/Neo was generated, in which the reporter gene d2EGFP is under the control of a synthetic promoter, which consists of four NF-kappaB binding sites and the minimal thymidin kinase promoter. In this human embryonic kidney (HEK) cell line, UVA induced gene expression can be measured as an increase of EGFP fluorescence. TNF-alpha treatment of cells gave rise to substantial d2EGFP expression in up to 90 % of the cells and was therefore used as a positive control of induction of NF-kappaB dependent gene expression. UVC and UVB radiation caused no increase in d2EGFP expression, X-rays did so only at high doses. Treatment of cells with the tumour promoter PMA produced d2EGFP expression in up to 40 % of the population. The detection of this induced d2EGFP expression required FACS analysis or inspection in the fluorescence microscope, measurement in the microplate reader was impossible due to the low fluorescence intensity.