Vergleichende Untersuchungen zu Schnellmethoden für den Nachweis thermophiler Campylobacter spp. in natürlich und artifiziell kontaminiertem Geflügelfleisch und -innereien sowie in Geflügelkot

Abstract

Die humane Campylobacteriose ist mit 61.823 gemeldeten Erkrankungsfällen im Jahr 2005 neben der Salmonellose die häufigste bakteriell bedingte meldepflichtige Infektionskrankheit des Menschen in Deutschland. Mit 55.321 gemeldeten Fälle aus dem Jahre 2004 waren im Folgejahr 6.502 mehr Campylobacteriose-Fälle zu verzeichnen gewesen. Auf Grund dessen ist im Sinne eines risikoorientierenden Verbraucherschutz eine schnelle und verlässliche Keimdetektion notwendig, um mikrobiologische Risiken im Lebensmittelverkehr frühzeitig aufdecken zu können. Die klassisch-kulturellen Nachweisverfahren für thermophile Campylobacter spp. sind zeitaufwendig und benötigen ein auf die jeweilige Keimart geschultes Laborpersonal. Zum zeitnahen Screening von potentiell mit Campylobacter spp. belasteten Proben sind ständig neue, weiterentwickelte Nachweissysteme notwendig. Zur Etablierung solcher Systeme in die Routinediagnostik sind Validierungsmaßnahmen notwendig. So wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit drei neue qualitative Schnellmethoden zur Detektion von thermophilen Campylobacter spp. untersucht. Dabei wurde ihre Praxistauglichkeit anhand von kardinalen Validierungsparametern abschätzbar gemacht. Zwei kommerziell erhältliche immunologische Nachweissysteme und ein molekularbiologisches Nachweissystem wurden der kulturellen Referenzmethode nach ISO 10272 gegenübergestellt. Geflügelfleisch, Geflügelinnereien und Geflügelkot wurden in den genannten Systemen auf thermophile Campylobacter spp. qualitativ untersucht. Durch die Verwendung eines in Vorversuchen ermittelten Verfahrens zur künstlichen Kontamination von Geflügelfleisch mit Campylobacter spp. sind definierte Keimkonzentrationsstufen in einer Probenmatrix erreicht worden. Das hierbei erhaltene artifiziell kontaminierte Geflügelfleisch in Form eines Modellbrätes ist den zu prüfenden Systemen zugeführt worden. Das Vorkommen von thermophilen Campylobacter spp. in Geflügelproben unterschiedlicher Probenart (Fleisch, Innereien) und unterschiedlichen Angebotszustandes (frisch, gefroren) ist ermittelt worden. Aus mit thermophilen Campylobacter spp. natürlich kontaminierten Lebensmittelproben sind hohe Nachweisraten zu verzeichnen. Insbesondere aus frischen Geflügelproben ließen sich signifikant höhere Nachweisraten gegenüber gefrorenen Produkten feststellen. Hohe Campylobacter-Nachweisraten aus Putenkottupferproben waren ebenfalls festzustellen. Folglich muss mit stark belasteten Herden am Schlachthof gerechnet werden. Der Schlachtprozess stellt aufgrund ermittelter hoher Kontaminationsraten in den Lebensmittelproben keine Hürde für das Überleben von Campylobacter spp. dar. Vielmehr ist hier mit einer erheblichen Kreuzkontamination zu rechnen. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass hohe Probendurchsätze mit den drei alternativen Systemen möglich sind, wobei die Nachweiszeit von Campylobacter spp. im Vergleich zum kulturellen Referenzverfahren erheblich reduziert werden kann. Zeitvorteil haben insbesondere die beiden immunologischen Methoden für betriebliche Eigenkontrollen (HACCP). Präsumtiv positive Ergebnisse können schon am zweiten Tag vorliegen. In der amtlichen Lebensmittelüberwachung kann auf die kulturelle Bestätigung präsumtiv positiver Proben nicht verzichtet werden. Der zeitliche Aufwand für die kulturelle Isolierung und Speziesdifferenzierung Campylobacter-positiver Proben nach der kulturellen Referenzmethode beträgt insgesamt mindestens sechs Tage. Als Screening-Test verkürzt das ELFA bzw. GLISA Verfahren inklusive der kulturellen Bestätigung präsumtiv positiver Proben den Nachweis von Campylobacter spp. um drei Tage. Die hier angewandten immunologischen Methoden erweisen sich als spezifische und für ihr Verfahrensprinzip sensitive Nachweissysteme, wobei der ELFA sensitiver ist als der GLISA. Beide Methoden sind schnell erlernbar und können im Routinelabor einfach durchgeführt werden. Der Nachweise über die hier angewandte molekularbiologische Methode ist in der Routinediagnostik in einem spezialisierten Labor für den sehr sensitiven und schnellen Nachweis von Campylobacter coli und Campylobacter jejuni aus Proben von Geflügelfleisch, Geflügelinnereien sowie Geflügelkot geeignet. So sind positive Ergebnisse inklusive der 48 h Anreicherungszeit nach drei Tagen möglich. Der molekularbiologische Nachweis ist von den alternativen Systemen am sensitivsten. Molekularbiologische Produkte sind zu verifizieren. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass neue Nachweisverfahren zur Campylobacter- Detektion vorliegen und verstärkt in der Routinediagnostik etablierbar wären. Neben den schon etablierten klassisch-kulturellen Verfahren sollten zukünftig verstärkt neue validierte Methoden Eingang in anerkannte Methodensammlungen (z. B. Methoden-sammlung nach § 64 LFGB) finden, um den Verbraucherschutz weiterhin effektiv gestalten zu können und die Lebensmittelüberwachung im Sinne der europäischen Basisverordnung from stable to table zu gewährleisten.

Human Campylobacteriosis is the most frequent disease to be notified to the authorities caused by bacteria in Germany besides Salmonellosis. In 2005 about 61.823 cases have been reported. These are 6.502 more than the year before, when 55.321 have been counted. Therefore a rapid and reliable detection of pathogenic organisms is needed to ensure microbiological safety and quality. The classical cultural methods for the detection of Campylobacter spp. are time-consuming and well trained laboratory personal is required for each type of bacteria. To examine samples potentially contaminated by Campylobacter spp. just in time, new and more specific screening methods have to be developed. Those methods have to be evaluated in order to establish such new systems in routine diagnostics. In this study three new rapid screening methods for the qualitative detection of thermophilic Campylobacter spp. were investigated. The practical orientation was estimated using essential parameters of evaluation. Two commercially purchasable immunological systems and one genotypical method were compared with the cultural reference method following ISO 10272. Poultry meat, poultry giblets and faeces of poultry were examined for thermophilic Campylobacter spp. in the three systems qualitatively. Artificially contaminated meat was used in the three systems, too. Definitive concentrations of Campylobacter spp. in poultry meat were accomplished by using a process encountered in previous studies of artificial contamination. The incidence of thermophilic Campylobacter spp. was investigated in poultry parts of different type (meat, giblets) and different terms of storage (fresh, frozen). High rates of contamination were found in poultry samples naturally contaminated by Campylobacter spp. Especially in fresh samples Campylobacter spp. was isolated significant more often compared to frozen samples. In faeces of poultry high rates of contamination were found as well. Therefore flocks carrying a heavy burden may be found at the abattoir. Because of the high rates found, the slaughtering process seems not to mean an obstacle to the survival of Campylobacter spp.. Rather considerable cross contamination has to be expected. The results of this study show that high numbers of samples can be examined in all three alternatives systems taking far less time compared to the cultural reference method. Especially the both immunological systems are favourable for HACCP in terms of timesaving. Presumptive positive results can be obtained within two days. In official food surveillance presumptive positive samples have to be confirmed by cultural methods. It takes about six days to isolate and specify Campylobacter spp. through the cultural reference method. ELFA or rather GLISA shortens the time to proof contamination with Campylobacter spp. by three days including cultural confirmation of presumptive samples. The two immunological methods evaluated in this study, proof to be specific and sensitive, accounting to their proceeding principles. ELFA is even more sensitive than GLISA. Both methods are rapidly learnable and can be easily established in routine diagnostics. The genotypical method compared in this study is a very sensitive and rapid system to detect thermophilic species Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in meat, giblets and faeces of poultry. It can be established for routine diagnostics in specialized laboratories only. Positive results can be obtained after three days, including 48 h for enrichment. It is the most sensitive method of the three tested alternative systems. PCR products should be verified. The results of this study show that new systems for the rapid screening of Campylobacter spp. exist and that they could be established in routine diagnostics. To ensure microbiological safety and quality of consumer protection even more effectively new methods should find entry into the acknowledged collections of methods (like in § 64 LFGB). This will help to guarantee the quality of food surveillance in implication of the European order from stable to table .