Etablierung eines Real - Time- PCR Assays im peripheren Blut für Thyreoglobulin mRNA

Abstract

Trotz der guten Prognose von differenzierten Schilddrüsenkarzinomen (DTC) erleiden ca. 30% der Patienten innerhalb der ersten zehn postoperativen Jahre Metastasen, so dass der Nachsorge eine große Bedeutung zukommt. Die immunometrische Bestimmung von Serum Thyreoglobulin (S-Tg), ist nach Thyreoidektomie und Radiojodablation in der DTC Nachsorge ein verlässlicher und sensitiver Parameter eines Rezidivs in hypothyreoter Stoffwechsellage. Allerdings bilden ca. 20% der differenzierten Schilddrüsenkarzinome Thyreoglobulinantikörper aus, die neben der molekularen Heterogenität des Tg - Moleküls ursächlich für falsch negative Ergebnisse im Immunoassay sein können. Eine alternative und möglicherweise sensitivere Methode stellt der quantitative PCR Assay für Tg mRNA im peripheren Blut dar. Im etablierten Real Time PCR Assay für Tg/GAPDH mRNA konnte eine ausreichende Sensitivität mit einem Detektionslimit von 1 Zelle/ml EDTA - Blut sowie Tg mRNA Spezifität dokumentiert werden. Die Tg mRNA Konzentration wurde normiert auf die mRNA des housekeeping genes glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH). Der nachgewiesene Tg/GAPDH mRNA Anstieg nach rekombinanter Thyreotropin Behandlung in DTC Patienten (n=4) bestätigte eine gute Dynamik des PCR Assays z. B. zur Erfassung von Tg mRNA Konzentrationserhöhung bei Tumorprogress. In der vorliegenden Arbeit dienten ein RNA - Mix gesunder Probanden (n=10) als Positivkontrolle und konnatal athyreote Patienten (n=4) als Negativkontrolle. Tg/GAPDH mRNA und S-Tg Protein waren in DTC Patienten (n=12) nach Thyreoidektomie und Radiojodtherapie nachweisbar. Es fiel eine hohe individuelle Tg mRNA Konzentrationsbreite auf; eine Korrelation der Tg/GAPDH mRNA zum klinischen Stadium und/oder Krankheitsverlauf ergaben sich jedoch nicht. Unerwartet war der Nachweis von Tg mRNA und Protein im peripheren Blut konnatal athyreoter Patienten, die als Negativkontrolle dienen sollten. Eine plausible Erklärung ist die im Northern Blot in vielen Geweben extrathyreoidal nachgewiesene Tg mRNA Expression wie z. B. Speicheldrüse, Trachea, Niere, Pankreas, Neben Niere, etc. Die nachgewiesene ektope Tg mRNA Expression erklärt auch zum Teil die individuell unterschiedlichen Tg/GAPDH mRNA Konzentrationen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der real time PCR Assays neben thyreoidaler auch extrathyreoidale Tg mRNA wie z. B. aus Leukozyten nachweist. Zusammenfassend erscheint zum jetzigen Zeitpunkt bei individuell schwankender, extrathyreoidaler Tg mRNA Expression und fehlender Korrelation der Tg mRNA Konzentration mit dem Krankheitsstadium, der routinemäßige klinische Einsatz der Real Time PCR für Tg mRNA in der DTC Nachsorge nicht sinnvoll.

Patients with differentiated thyroid cancer (DTC) normally have a good prognosis, but within 10 years after initial treatment 30% recurrence of metastases is observed. Serum thyroglobulin protein (S-Tg), measured by immunometric assay, is a sensitive and widely used diagnostic clinical marker for thyroid cancer progression and relapse in hypothyroidism. To date, the determination of S-Tg after thyroidectomy and radioiodine therapy is limited by unsufficient sensitivity and susceptible to interference by Tg autoantibodies in 20% of DTC and Tg protein heterogenity. As a possible sensitive diagnostic alternative, we established a quantitative real time PCR assay to determine Tg mRNA levels in peripheral whole blood samples with a target specific detection limit of 1 cell / ml EDTA-blood sample. Tg mRNA levels are calibrated to the mRNA encoding the housekeeping gene glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH). Adequate dynamic property was confirmed by measurement of increasing Tg mRNA levels after recombinant human thyrotropin stimulation in four patients with DTC (n = 4); it seems that Tg mRNA increase is an appropiate marker of tumor progress. Pooled blood from ten healthy subjects (n = 10) and from four patients with congenital athyreosis (n = 4) served as positive and negative controls, respectively. Tg mRNA was detectable in all investigated thyroidectomized and radioiodine treated DTC patients (n = 12). But Tg mRNA values are highly variable and did not correlate with corresponding S-Tg protein concentrations or clinical stage. Unexpectedly, Tg mRNA and protein were also detected in congenital athyreotic patients; primary are intended for negative control. This is plausible explainable by Tg mRNA expression in several extrathyroidal tissues (salivary gland, trachea, kidney, pancreas, adrenal gland, etc.) detected by Northern blot. Our data suggests that real time PCR detects Tg mRNA of thyroidal origin including metastases of DTC and also extrathyroidal sources like leukocytes. In conclusion, the clinical use of quantitative real time PCR for evaluation of Tg mRNA as a tumor marker is limited by individually varying interference of ectopic Tg mRNA expression thereby explaining poor correlation of measured values and clinical stage.