Global protein analyses of canine mammary gland tumors

Abstract

Although scientists worldwide do research on tumor development and metastatic cascade of canine tumors, many molecular details of this process are still unknown. For instance, it is still an intricate problem to distinguish between a non-metastasizing and a metastasizing canine mammary carcinoma before metastases are actually detectable. Furthermore, it is unclear whether metastatic behavior is an early inherent feature or a late result of a linear malignant progression. Therefore, the present study visualized and compared the protein expression patterns of canine normal mammary gland, adenomas, non- metastasizing and metastasizing carcinomas (each n=6) by two-dimensional difference gel electrophoresis and identified subsequently differentially expressed proteins by mass spectrometry. Differentiation of nonmetastasizing and metastasizing carcinomas was based on the histological examined lymph node status at the time of surgical excision of the primary tumor mass. The following two hypotheses were tested here: 1\. The metastatic potential of canine mammary tumors is reflected in the protein expression patterns and these differentially expressed proteins reveal potential metastasis markers. 2\. Carcinogenesis of canine mammary tumors is associated with malignant progression from normal mammary gland towards metastasizing carcinomas. On the molecular level, this malignant progression is associated with a continuous and linear change of quantitative protein expression levels over the subsequent stages of malignancy. In total, 48 different proteins featured significant changes in the comparisons: normal mammary gland versus adenomas, adenomas versus non-metastasizing carcinomas and non-metastasizing versus metastasizing carcinomas. Most of them followed three major expression patterns, which were designated as “adenoma pattern”, “carcinoma pattern” and “metastasis pattern”. The main characteristic of these patterns was a stepwise but not linear increase or decrease in protein expression with a subsequent persistence on the same expression level in the consecutive tumor stages. Interestingly, the comparison of nonmetastasizing and metastasizing carcinomas revealed the majority of differentially expressed proteins, notwithstanding their histological similarity. Since many of these proteins have been described as relevant for carcinogenesis and metastasis in other species or other cancer types before, they may serve as potential metastasis markers for canine mammary tumors in the future. In conclusion, the first hypothesis was supported since metastasis-associated proteins were identifiable in the present global protein analysis. On the contrary, the second hypothesis was not supported since no continuous and linear change of quantitative protein expression levels was detectable over the different stages of increasing malignancy.

Obwohl Mammatumoren seit längerer Zeit im Mittelpunkt der Forschung stehen, sind noch immer viele Aspekte ihrer Entstehung und molekularbiologische Details ihrer Metastasierung unbekannt. Beispielsweise stellt sich eine frühe Differenzierung zwischen nichtmetastasierenden und metastasierenden Karzinomen noch immer als sehr schwierig dar, bevor Metastasen detektierbar sind. Darüber hinaus ist bis heute nicht geklärt, ob Tumorzellen von Beginn an metastatisches Potential besitzen, oder es erst im Zuge der so genannten linearen malignen Progression entsteht. Um diesen Fragen auf den Grund zu gehen, wurden in der vorliegenden Studie die Proteinexpressionsmuster von gesunder Milchdrüse, Adenomen, nicht-metastasierenden und metastasierenden Karzinomen der Milchdrüse des Hundes (je n=6) mittels zweidimensionaler differenzieller Gelelektrophorese verglichen und differenziell exprimierte Proteine im Anschluss mittels Massenspektrometrie identifiziert. Die Unterscheidung von nicht-metastasierenden und metastasierenden Karzinomen erfolgte anhand des histologischen Lymphknotenstatus zum Zeitpunkt der Entfernung des Primärtumors. Die Prüfung der folgenden zwei Hypothesen stand im Mittelpunkt dieser Arbeit: 1\. Metastatisches Potential von kaninen Mammatumoren spiegelt sich in deren Proteinexpressionsmustern wieder und die dabei unterschiedlich exprimierten Proteine stellen potentielle Metastasierungsmarker dar. 2\. Die Karzinogenese kaniner Mamatumoren ist mit einer malignen Progression vom Normalgewebe hin zum metastasierenden Karzinom assoziiert, welche sich auf molekularbiologischer Ebene durch einen kontinuierlichen und linearen An- oder Abstieg in der Proteinexpression auszeichnet. Insgesamt zeigten 48 verschiedene Proteine signifikante Expressionsunterschiede in den folgenden Vergleichen: Normalgewebe versus Adenome, Adenome versus nichtmetastasierende Karzinome und nicht- metastasierende Karzinome versus metastasierende Karzinome. Die meisten dieser Proteine folgten einem der drei Expressionsmuster, welche wie folgt benannt wurden: „Adenommuster“, „Karzinommuster“ und „Metastasierungsmuster“. Charakteristisch für die einzelnen Muster waren jeweils der stufenweise An- oder Abstieg in der Proteinkonzentration zwischen zwei Tumorstadien und die anschließende Persistenz auf dem erreichten Niveau in allen nachfolgenden Stadien. Interessanterweise ergab der Vergleich von nicht-metastasierenden und metastasierenden Karzinomen die meisten differentiell exprimierten Proteine, obwohl sich diese beiden Tumorstadien histologisch kaum unterscheiden. Da viele der identifizierten Proteine bereits als relevant für die Karzinogenese und Metastasierung beschrieben, allerdings noch nicht im Zusammenhang mit kaninen Mammatumoren erwähnt wurden, stellen diese potentielle neue Metastasierungsmarker für die Tiermedizin dar. Abschließend kann die erste Hypothese unterstützt werden, da Metastasierungs-assoziierte Proteine in der vorliegenden globalen Proteinexpressionsanalyse identifiziert wurden. Die zweite Hypothese hingegen konnte nicht gestützt werden, da keines der identifizierten Proteine einen kontinuierlichen und linearen An- oder Abstieg in seiner Expression über alle Malignitätsstufen hinweg aufwies.