Charakterisierung der fibrinolytischen Aktivität in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit beim chronisch lungenkranken Pferd und der Einfluss einer inhalativen Glukokortikoidtherapie

Abstract

Charakteristisch für chronische Atemwegserkrankungen sind langanhaltende und immer wiederkehrende Entzündungsprozesse im Respirationstrakt – Fibrosierungen des Lungengewebes und damit einhergehende persistierenden Einschränkungen in der Lungenfunktion sind die Folge. In der Humanmedizin konnte bei verschiedenen respiratorischen Erkrankungen (u.a. Asthma) ein prokoagulatorisches und antifibrinolytisches Milieu im Alveolarraum als Ursache progressiver Fibrosierungsprozesse ausgemacht werden. Beobachtungen aus der veterinärmedizinischen Literatur liefern Hinweise darauf, dass auch bei chronischen Lungenerkrankungen des Pferdes eine vergleichbare Hämostase- Dybalance in den Alveolen vorliegen könnte. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, in einer prospektiv-klinischen Studie unter Einschluss einer gesunden Kontrollgruppe die fibrinolytische Aktivität in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) chronisch lungenkranker Pferde zu charakterisieren und einen pathogenetischen Zusammenhang herauszustellen. Hierfür sollten das Fibrinogen, die D-Dimere sowie Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) und Urokinase (u-PA) untersucht werden. Es stellte sich jedoch heraus, dass ein Nachweis von PAI-1 und u-PA mit verlässlicher Aussagekraft nicht möglich war. Zusätzlich zu den hämostatischen Parametern sollte auch das Serum-Amyloid-A in der BALF bestimmt werden. Alle Parameter wurden darüber hinaus auf Veränderungen im Rahmen einer inhalativen Glukokortikoidtherapie mit kombinierter Haltungsoptimierung untersucht. Für die vorliegende Studie wurden 61 Tiere an der Klinik für Pferde, allgemeine Chirurgie und Radiologie der Freien Universität Berlin stationär aufgenommen und einem dreitägigen Untersuchungsprotokoll unterzogen. Dieses umfasste eine allgemeine und spezielle klinische Untersuchung, eine venöse und arterielle Blutanalyse, eine Belastungsuntersuchung, eine Interpleuraldruckmessung, eine Tracheobronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage inklusive zytologischer Auswertung und eine röntgenologische Untersuchung der Lunge. Auf Grundlage der erhobenen Befunde und in Anlehnung an die in aktueller Literatur festgelegten Definitionskriterien wurden die Probanden in die folgenden fünf Diagnosegruppen eingeteilt: „Gesund“ (Gruppe 1, n=15), „COB in Exazerbation“ (Gruppe 2, n= 18), „IAD/COB in Remission“ (Gruppe 3, n=14), „interstitielle Pneumopathie“ (Gruppe 4, n=11) und „akute/subakute Pneumonie“ (Gruppe 5, n=3). Acht Patienten aus Gruppe 2 sowie vier Pferde aus Gruppe 3 erhielten eine zehntägige Inhalationstherapie mit dem Glukokortikoid Budesonid (3 μg/kg KGW, zweimal täglich) bei gleichzeitig staubarmen Haltungsbedingungen (Späne, nasses Heu), gefolgt von einer Kontrolluntersuchung, die im Wesentlichen dem Protokoll der Erstuntersuchung entsprach. Die weiterführenden Laboranalysen erfolgten aus dem Überstand der abzentrifugierten BALF. Das Fibrinogen und die D-Dimere wurden auf vollautomatischen Analysegeräten unter Anwendung immunturbidimetrischer Verfahren bestimmt. Für das SAA kam die ELISA-Methode zum Einsatz. Auch PAI-1 und u-PA sollten mit diesem quantitativen Nachweisverfahren bestimmt werden, was sich jedoch als nicht durchführbar erwies. Für die Fibrinogenkonzentration zeigte sich, dass der Median der lungenkranken Tiere deutlich über dem der gesunden Kontrollgruppe lag. Letztere wies zudem mit rund 60 % die geringste Nachweisbarkeit auf und unterschied sich damit signifikant (p=0,03) von der Gruppe 2 („COB in Exazerbation“), bei der in 94 % der Fälle Fibrinogenkonzentrationen gemessen werden konnten. Daraus ergab sich für Patienten mit Konzentrationen über der Nachweisgrenze von 0,001 g/l eine 11mal höhere Wahrscheinlichkeit, die Diagnose „COB in Exazerbation“ zu erhalten, anstatt als gesund eingestuft zu werden (Exp(B)=11,33). Darüber hinaus zeigte sich eine schwach positive Korrelation (rs=0,377; p=0,004) zwischen der Fibrinogenmenge und dem prozentualen Anteil neutrophiler Granulozyten in der BALF. Die D-Dimere konnten allein bei Pferden mit der Diagnose „COB in Exazerbation“ und „akute/subakute Pneumonie“ nachgewiesen werden. Hierbei wurde der Großteil der Messergebnisse erst im Anschluss an ein Proteinanreicherungs-Verfahren erbracht. Es ergab sich ein positiver Zusammenhang (rs=0,511; p=0,03) zwischen der D-Dimer-Konzentration und der durchschnittlichen Atemfrequenz der Patienten. Das Serum-Amyloid-A konnte in deutlich mehr als der Hälfte aller Proben (67,2 %) nicht wiedergefunden werden und es stellte sich für die gesunden wie kranken Tiere ein Median von 0,05 μg/ml heraus. Die therapeutische Intervention führte zu einer tendenziellen Verringerung insbesondere der Fibrinogen-, aber auch der D-Dimer-Konzentrationen in der BALF. Dieser Unterschied stellte sich als nicht signifikant heraus. Mangels funktionierender Testverfahren zur Bestimmung spezifischer Firbinolyse- Parameter konnte nur ein Teil der gesetzten Ziele in dieser Arbeit erreicht werden. Dennoch liefern die vorliegenden Beobachtungen neue Erkenntnisse für die Grundlagenforschung bei chronischen respiratorischen Erkrankungen des Pferdes. Die Ergebnisse bieten deutliche Anhaltspunkte für die Annahme, dass hierbei hämostatische Dysbalancen mit vermehrter Fibrinbildung eine zentrale Rolle im Pathomechanismus spielen. Insbesondere das Wissen über irreversible Veränderungen im Lungengewebe und persistierende Lungenfunktionsstörungen betroffener Tiere geben Anlass, diesen Forschungsansatz zu verfolgen und mögliche Veränderungen in der fibrinolytischen Aktivität in weiterführenden Studien aufzudecken.

A main characteristic of chronic respiratory disease is the long-lasting and recurring inflammatory process in the small airways – resulting in fibrosis of the alveolar tissue and thus an irreversible loss of respiratory capacity. In various human respiratory diseases like bronchial asthma a pro-coagulatory and antifibrinolytic environment has been shown to cause progressive fibrosis. Observations from veterinary medicine hint at a comparable misbalance of the hemostasis in chronic airway diseases of the horse. The goal of this prospective clinical study including a healthy control group was to measure the fibrinolytic activity in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of horses with chronic pulmonary disease and evaluate a possible pathogenetic association. Fibrinogen, D-dimers, plasminogen-activator-inhibitor-1 (PAI-1) and urokinase (u-PA) were to be examined in this study. Unfortunately, all tested assays for PAI-1 and u-PA showed unreliable and inconsistent results. In addition to the hemostatic parameters, serum-amyloid-A in the BALF was determined as an acute-phase protein. Furthermore, all parameters were examined regarding changes to an inhalative therapy with glucocorticoids and low-dust environment. In this clinical trial 61 horses were presented to the Equine clinic for surgery and radiology of the Freie Universität Berlin under stationary conditions and underwent a three day preparticipation examination including general and specific clinical examinations, venous and arterial blood gas analyses, exercise tests, interpleural pressure measurements, radiography of the thorax, endoscopic and cytologic examinations of BALF. The subjects were classified as “healthy controls“ (group 1, n=15), “COB in exacerbation“ (group 2, n=18), “IAD/COB in remission“ (group 3, n=14), “interstitial pneumopathy“ (group 4, n=11) and “acute/subacute pneumonia“ (group 5, n=3). Eight patients from group 2 and four patients from group 3 received a ten day inhalation therapy with the glucocorticoid budesonide (3 μg/kg BDW, bid) and were housed in a lowdust environment. A control examination largely identical to the preparticipation examination followed. Further laboratory analyses were conducted with the supernatant of the centrifuged BALF. Fibrinogen and D-dimers were determined on a fully-automatic analyzer using the immunoturbidimetric method. SAA was measured by the ELISA method. This quantitative analysis procedure was also intended to be applied for the examination of PAI-1 and u-PA, however, this turned out to not be technically feasible. The median of fibrinogen in patients with lung diseases was considerably higher than the one in healthy horses. Moreover, the healthy control group showed a significantly (p=.03) lower detectability of about 60%, compared to group 2 (“COB in exacerbation”), where fibrinogen concentrations could be measured in 94% of the cases. Thus, cases with a fibrinogen level above the determination limit of 0.001 g/l were eleven times more likely of being diagnosed “COB in exacerbation” than being classified as “healthy” (Exp(B)=11.33). Furthermore, there was a weak positive correlation (rs=.377; p=.004) between the fibrinogen content and the percentage of neutrophils in the BALF. D-dimers could be detected exclusively in patients with the diagnosis “COB in exacerbation” and “acute/subacute pneumonia”. The majority of these results could be obtained only subsequent to a protein enrichment procedure. There was a positive correlation (rs=.511; p=.03) between the amount of D-dimers and the average respiratory rate. SAA could not be detected in more than two thirds of the samples (67.2%), while the median was 0.05 μg/ml for both controls and affected horses. The therapeutic intervention resulted in a partial decrease of specifically the fibrinogen levels, but also the D-Dimer levels in the BALF. However, these differences could not be classified as significant. Due to a lack of appropriate testing methods to determine specific parameters of fibrinolysis, the aims of the presented study could only be reached in part. However, the observations reveal new insights for basic research in chronic respiratory diseases of the horse. The results allow the assumption that a misbalance in hemostasis accompanied by increased fibrin turnover plays a key role in the pathomechanism of equine pulmonary disease. Particularly with regard to irreversible alterations of lung tissue and persistent pulmonary function impairment, this research approach should be further pursued to reveal possible changes in fibrinolytic activity.