Docosahexaenoic acid suppresses arachidonic acid-induced proliferation of LS 174T human colon carcinoma cells

Abstract

Background: Colorectal cancer (CRC) is one of the leading causes of death in Western countries. A potential role of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids (n-3 and n-6 PUFAs) in the context of CRC has been implicated by numerous epidemiological studies, suggesting a protective role of n-3 PUFAs. On the other hand it is well-established that prostaglandin E2 (PGE2), generated from n-6 PUFA arachidonic acid (AA), is an important promoting factor in the tumorigenesis of the colorectum. In this context it has been proposed that the human genetic profile was originally established on a n-6 to n-3 PUFA ratio of approximately 1:1 as found in “ancient” diets, whereas today’s Western diet has been estimated to provide n-6 to n-3 PUFAs in a ratio of 15:1–20:1. It has been hypothesized that this may contribute to many serious health issues typically found in Western societies, including CRC. However, previous in vitro observations have led to some uncertainty regarding differential roles of n-3 and n-6 PUFAs in CRC cells. While the majority of investigations conducted in this field addressed neither the effects of n-6 PUFAs nor the impact of a balanced n-6 to n-3 PUFA ratio, several other studies reported n-3 and n-6 PUFAs to exert anti-cancerous effects in vitro. Hence, it was the aim of the present study to investigate the impact of n-3 PUFA docosahexaenoic acid (DHA) and n-6 PUFA AA and their combination on CRC cell line LS 174T in vitro. Methods: In order to study the effects of n-3 PUFA DHA, n-6 PUFA AA, PGE2 and several combinations on cellular viability of LS 174T CRC cells, XTT assays were applied. Cell cycle and cell death were assessed via flow cytometry experiments and DAPI stainings. Moreover, mRNA expressions of cyclooxygenase-2 (COX-2), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and cyclin- dependent kinase inhibitor 1A (p21WAF1) in cells incubated with AA, DHA or vehicle were examined by semiquantitive real-time PCR (qRT-PCR). Biosynthesis of PGE2 in the presence of AA and DHA was measured in a PGE2-ELISA. Results: While incubation with n-6 PUFA AA increased cellular proliferation, supplementation of n-3 PUFA DHA significantly reduced cellular viability and induced apoptosis in a time- and dose-dependent manner. Moreover, DHA incubation potently decreased mRNA expression of anti-apoptotic Bcl-2 and induced the expression of cell cycle inhibitor p21WAF1. In contrast, incubation with AA resulted in a significantly increased expression of Bcl-2 mRNA, whereas amounts of p21WAF1 mRNA remained unaltered compared to control cells. In addition, AA incubation increased mRNA levels of COX-2, the key enzyme in AA-dependent PGE2 formation, and also resulted in a significant biosynthesis of PGE2, an important inductor of cellular proliferation in LS 174T cells. In contrast, DHA incubation decreased COX-2 mRNA expression and significantly diminished AA-induced PGE2 formation in co-incubation experiments. Importantly, results from co-incubations furthermore indicated DHA to potently reverse and suppress AA- as well as PGE2-induced CRC cell growth. Conclusion and impact: Results presented here clearly demonstrate diametrically opposing effects of n-3 PUFA DHA and n-6 PUFA AA in regard of cellular viability and mRNA regulation, thus helping to clarify the aforementioned uncertainty concerning differential effects of n-3 and n-6 PUFAs in vitro. As novel aspect in this context, the present investigation addresses the interplay between AA and DHA in the context of CRC cells in vitro. AA/DHA co-incubations, leading to an (almost) balanced n-6 to n-3 ratio, thus mimicking conditions found in “ancient” diets, showed DHA to potently reverse pro-proliferatory effects of n-6 PUFA AA and of AA-derived PGE2 towards growth inhibition. Thus, our data add evidence to the argument that the ratio of n-6/n-3 PUFA (particularly the ratio of AA/DHA) may be a critical determinant of proliferation and tumor growth in CRC. However, further in vitro and in vivo studies are required in order to fully elucidate this interplay and its clinical impact and relevance. As another important aspect, DHA potently diminished PGE2 formation from exogenous AA and decreased mRNA expression of COX-2. This may be of special interest in regard of CRC prevention as pharmacological inhibition of COXs (via ASS and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs), subsequently reducing PGE2 synthesis, has been found to be protective against CRC development. Nevertheless, long term use of these drugs is associated with severe adverse effects and is a matter of ongoing debate. Thus, based upon the present data and previous studies, n-3 PUFAs including DHA may be hypothesized as an alternative preventive agent against CRC, also interfering with the AA-associated metabolism. However, besides interaction with the COX-dependent AA metabolism, data of the present study additionally suggest DHA to exert its anti-cancerous actions also via COX- and AA-independent pathways, which yet remain to be fully understood by future investigations. In conclusion, although deduced from a limited in vitro setup, the present study provides significant evidence concerning beneficial effects of DHA as well as for the pivotal importance of n-6 to n-3 ratio in the context of CRC.

Hintergrund: Das kolorektale Karzinom stellt eine der häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrienationen dar. Zahlreiche epidemiologische Studien weisen in diesem Zusammenhang auf einen Einfluss mehrfach ungesättigter Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren (n-3 PUFAs und n-6 PUFAs) hin, wobei n-3 PUFAs im Allgemeinen eine protektive Wirkung zugeschrieben wird. Andererseits ist bekannt, dass Prostaglandin E2 (PGE2), ein aus der n-6 PUFA Arachidonsäure (AA) synthetisierter Lipidmediator, die kolorektale Karzinogenese fördert. In diesem Kontext wurde postuliert, dass sich das menschliche Genprofil ursprünglich auf Basis einer Ernährung mit ausgeglichenem n-6 zu n-3 PUFA- Verhältnis entwickelte, während das n-6 zu n-3 PUFA-Verhältnis heutiger westlicher Nahrung bei etwa 15:1-20:1 liegt. Diese veränderte Nahrungszusammensetzung wird von vielen Experten für die hohe Prävalenz vieler sogenannter „Wohlstandskrankheiten“, zu denen auch das kolorektale Karzinom zählt, mitverantwortlich gemacht. In bisherigen in vitro-Untersuchungen zeigte sich jedoch kein einheitliches Bild bezüglich unterschiedlicher Wirkungen von n-3 und n-6 PUFAs auf Kolonkarzinomzellen. Während die meisten Studien in diesem Gebiet weder die Effekte von n-6 PUFAs noch den Einfluss des n-3 zu n-6 PUFA-Verhältnisses untersuchten, zeigten andere Veröffentlichungen antikanzerogene Wirkungen beider Fettsäureklassen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Wirkung der n-3 PUFA Docosahexaensäure (DHA), der n-6 PUFA AA und des AA-basierten Lipidmediators PGE2 sowie deren Kombination auf die Kolonkarzinom-Zelllinie LS 174T zu untersuchen. Methoden: Der Einfluss von DHA, AA, des Lipidmediators PGE2 und deren Kombination auf Überleben und Wachstum der Kolonkarzinom-Zelllinie LS 174T wurden mittels XTT Assays untersucht. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie und DAPI-Färbungen wurden die Effekte der Fettsäuren auf Zellzyklus und Zelltod evaluiert, während der Einfluss beider Fettsäuren auf die mRNA-Expression von Cyclooxygenase-2 (COX-2), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) und Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21WAF1) durch semiquantitive real-time PCR ermittelt wurde. Zusätzlich wurde der Einfluss von AA und DHA auf die PGE2-Synthese durch ELISA-Untersuchungen quantifiziert. Ergebnisse: Während die Inkubation mit der n-6 PUFA AA die Proliferation der LS 174T Zellen anregte, reduzierte DHA zeit- und dosisabhängig das Überleben der Karzinomzellen und induzierte Apoptose. Weiterhin verminderte die Inkubation mit DHA die mRNA-Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 und erhöhte dan mRNA-Level des Zellzyklusinhibitors p21WAF1. Im Gegensatz hierzu führte die Zugabe von AA zur vermehrten Expression von Bcl-2-mRNA, während sich die Menge an p21WAF1-mRNA unverändert zeigte. Daneben induzierte die Inkubation mit AA die mRNA- Expression von COX-2 (dem Schlüsselenzym der AA-abhängigen PGE2-Synthese) und resultierte außerdem in einer gesteigerten PGE2-Biosynthese. Demgegenüber verminderte die Inkubation mit DHA sowohl die Expression von COX-2-mRNA als auch die AA-induzierte PGE2-Synthese. Weitere Koinkubationsexperimente zeigten, dass DHA dem AA- und PGE2-induzierten Wachstum in LS 174T entgegenwirkt. Diskussion und Fazit: Die vorliegende Studie zeigt gegensätzliche Effekte der n-3 PUFA DHA und der n-6 PUFA AA bezüglich Proliferation, Apoptose und mRNA-Regulation in der kolorektalen Karzinomzelllinie LS 174T und trägt somit dazu bei, die Wirkung dieser Fettsäuren weiter zu klären. Als neuer Aspekt wurde die Interaktion zwischen AA und DHA in vitro untersucht. AA/DHA-Koinkubationsexperimente mit einem (fast) ausgeglichenen Verhältnis von n-6 zu n-3 PUFAs (entsprechend der Zusammensetzung der Nahrung vor der Industrialisierung) zeigten, dass DHA sowohl dem AA- als auch dem PGE2-induzierten Wachstum entgegenwirkt. Diese Ergebnisse unterstreichen den Einfluss des n-6 zu n-3 Verhältnisses (im Besonderen AA zu DHA) im Kontext der kolorektalen Karzinogenese, wobei weitere in vitro- und in vivo-Studien nötig sind, um die Interaktion der unterschiedlichen Fettsäuren sowie deren klinische Relevanz vollständig zu erfassen. Daneben zeigen die vorliegenden Experimente, dass DHA sowohl die PGE2-Synthese aus exogen zugeführter AA als auch die mRNA-Expression des Schlüsselenzyms COX-2 reduziert. Dies ist insofern von besonderem Interesse, als dass die pharmakologische Inhibition der COXs (beispielsweise durch Acetylsalicylsäure oder andere nicht-steroidale Antiphlogistika) mit der hieraus resultierenden Reduktion der PGE2-Synthese präventiv gegen das kolorektale Karzinom wirkt, jedoch aufgrund der assoziierten Nebenwirkungen nicht allgemein empfohlen wird. In diesem Zusammenhang legen die vorliegenden Daten in Zusammenschau mit den Ergebnissen anderer Studien nahe, dass alternativ n-3 PUFAs wie DHA als präventive, mit dem AA-Metabolismus interferierende Substanzen eingesetzt werden könnten. Darüber hinaus wird aber aus den vorliegenden Daten zusätzlich deutlich, dass die anti-kanzerogenen Effekte von DHA zum Teil auch auf COX- und AA-unabhängigen Mechanismen basieren, die in zukünftigen Studien weiter erforscht werden sollten. Zusammenfassend liefert die vorliegende Studie neue und signifikante Hinweise bezüglich protektiver Effekte der n-3 PUFA DHA und hebt die Relevanz eines n-6 zu n-3 PUFA-Verhältnisses im Kontext des kolorektalen Karzinoms hervor.