Einfluss von Cytokinin auf die Organgröße und auf Entwicklungsübergänge in Arabidopsis thaliana

Abstract

Pflanzen durchlaufen während ihres Lebenszyklus verschiedene Entwicklungsphasen, die durch Ausprägung neuer morphologischer Merkmale und/oder Bildung neuer Organe gekennzeichnet sind. Die Größe und die Anzahl der in der vegetativen Phase gebildeten Blätter werden durch komplexe Netzwerke reguliert, die durch Umwelteinflüsse, genetische Faktoren und Phytohormone beeinflusst werden. Das zellteilungsfördernde Pflanzenhormon Cytokinin (CK) hat einen wesentlichen Einfluss auf die Wachstumsprozesse eines Organs. Ob CK dabei als nicht-zellautonomer Faktor zwischen verschiedenen Zellschichten eines sich entwickelnden Organs vermittelt, ist bisher nicht geklärt. Das Phytohormon ist zudem ein positiver Regulator der Blühinduktion. Da Pflanzen erst mit dem Übergang zur adulten vegetativen Phase Blühkompetenz erlangen, hat die Dauer der juvenilen Phase einen maßgeblichen Einfluss auf den Blühbeginn. Die Juvenil-adult-Transition wird durch die hochkonservierten microRNAs miR156 und miR172 sowie ihre jeweiligen Zielgene reguliert, wobei miR156 Juvenilität und miR172 den Übergang zur adulten und reproduktiven Phase fördert. Über einen Einfluss von CK auf die Juvenil-adult-Transition ist bislang nur sehr wenig bekannt und auch die molekularen Mechanismen, mit denen das Phytohormon Einfluss auf den Blühbeginn nimmt, sind weitestgehend ungeklärt. Im ersten Teilprojekt dieser Arbeit wurde der Einfluss des epidermalen Cytokininstatus auf das Spross-wachstum untersucht. Dafür wurden mehrere Promotor-Gen-Konstrukte kloniert und in Arabidopsis exprimiert. Der in der Epidermis aktive Promotor des ATML1-Gens wurde mit Genen kombiniert, welche die Cytokininsignaltransduktion hemmen (ARR1-SRDX) bzw. den Katabolismus (CKX1) oder die Biosynthese (LOG4) von CK fördern. Alle Transgene verursachten Veränderungen des Cytokininstatus, wobei ARR1-SRDX lokal in der Epidermis wirkte und CKX1 und LOG4 auch Effekte über die Expressionsdomäne hinaus bewirkten. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von pATML1:LOG4 und pATML1:CKX1-4xMyc die Größe des vegetativen Meristems beeinflusst, möglicherweise durch die Veränderung des von der L1 ausgehenden Cytokiningradienten. pATML1:LOG4-Pflanzen bildeten größere, pATML1:ARR1-SRDX- und pATML1:CKX1-Pflanzen kleinere Rosettenblätter, die durch Veränderungen der Zellteilungsaktivität bewirkt wurden. Die durch lokale Hemmung der Cytokininsignaltransduktion hervorgerufene Reduktion der epidermalen Zellteilung in pATML1:ARR1-SRDX beschränkte das Wachstum der subepidermalen Gewebe. Die Cytokininrezeptoren AHK2 und AHK3 sowie der Typ-B-ARR ARR1 konnten als vermittelnde Faktoren bei der Blattgrößendetermination in den pATML1-Linien identifiziert werden. Darüber hinaus konnten Effekte der Transgenexpression auf die Plazenta-Aktivität, die Apikaldominanz, den Stengeldurchmesser und das Wurzelwachstum beobachtet werden. Die Analyse der pATML1-Linien und weiterer Arabidopsis-Linien mit verändertem Cytokininstatus im zweiten Teilprojekt förderte eine von der Fotoperiode unabhängige, negative Korrelation zwischen dem Cytokininstatus und der Länge der juvenilen vegetativen Phase zutage, wobei der epidermale Cytokininstatus keinen wesentlichen Einfluss auf die Juvenil-adult-Transition zeigte. AHK2, AHK3 und ARR1 konnten als vermittelnde Faktoren der Cytokininsignalkaskade in diesem Prozess identifiziert werden. Neben der Länge der juvenilen Phase wurde der Blühzeitpunkt zudem durch den Einfluss von CK auf die Blattbildungsrate beeinflusst, wobei dem Rezeptor CRE1/AHK4 hierbei eine wesentliche Rolle zukommt. Expressionsanalysen zeigten, dass der positive Einfluss von CK auf Entwicklungsübergänge durch die transkriptionelle Aktivierung von MIR172-Genen zu erklären ist. In einem Yeast-one-hybrid-Matrix-ansatz konnte eine Bindung von ARR1, ARR2 und ARR12 an MIR172-Promotoren gezeigt werden, was eine direkte Aktivierung der MIR172-Transkription durch Typ-B-ARRs vermuten lässt. Expressionsanalysen und genetische Untersuchungen zeigten zudem, dass CK u. a. eine Hemmung der Expression des miR172-Zielgens SMZ bewirkt, welches für einen Blührepressor kodiert, der u. a. die Expression der Florigene FT und TSF reguliert. Da CK TSF in positiver Weise reguliert, kann die Hypothese aufge¬stellt werden, dass CK die TSF-Aktivierung möglicherweise u. a. über die Hemmung von SMZ erreicht.

Plants progress through a number of developmental transitions during their life cycle that are characterized by the development of new morphological traits and/or organs. The number and size of leaves formed during the vegetative phase is regulated by complex regulatory networks which are influenced by environmental cues and genetic factors as well as phytohormones. Cytokinins (CKs), a class of phytohormones which promote cell division, are known to contribute considerably to organ growth. However, it remains unclear whether CKs act as non-cell autonomous factors between different cell layers in developing organs. CKs are also positive regulators of flowering time. As plants acquire the competence to flower upon transition to the adult vegetative phase, the length of the juvenile phase considerably influences flowering time. The juvenile-to-adult phase transition is regulated by the highly conserved microRNAs miR156 and miR172 and their respective target genes. MiR156 promotes juvenility, while miR172 stimulates the transition to adult and reproductive growth. The impact of CKs on the juvenile-to-adult phase transition as well as the CK-related molecular mechanisms involved in flowering time determination are still poorly understood. In the first part of this study, the importance of the epidermal CK status for shoot growth was investigated by using promoter-gene constructs which were stably expressed in Arabidospis thaliana. The epidermis-specific ATML1 promoter was fused to the ORFs of genes inhibiting CK signal transduction (ARR1-SRDX), or promoting the catabolism (CKX1) or biosynthesis (LOG4) of CKs. The CK status was altered by all transgenes. ARR1-SRDX acted locally in the epidermis whereas CKX1 and LOG4 also caused effects outside of their expression domain. It was shown that expression of pATML1:LOG4 and pATML1:CKX1-4xMyc influences the size of the vegetative meristem, probably by altering the CK gradient originating from the L1 layer. Compared to the wildtype, rosette leaves of pATML1:LOG4 plants were bigger and those of pATML1:ARR1-SRDX and pATML1:CKX1 plants were smaller due to changes in cell proliferation activity. In pATML1:ARR1-SRDX plants, the reduction of epidermal cell division due to local inhibition of CK signal transduction restricted subepidermal tissue growth. The CK receptors AHK2 and AHK3 and type-B-ARR ARR1 were identified as factors controlling leaf size in pATML1 lines. Moreover, effects of transgene expression on placenta activity, apical dominance, stem diameter and root growth were observed. The analysis of pATML1 lines and additional Arabidopsis lines with altered CK status presented in the second part of this study allowed the identification of a photoperiod- independent negative correlation between CK status and length of the juvenile vegetative phase. However, no substantial influence of the epidermal CK status on juvenile-to-adult transition was observed. AHK2, AHK3 and ARR1 were identified as components of the CK signaling cascade involved in this process. Beside the length of the juvenile phase, flowering time was also affected by the impact of CK on the leaf formation rate, CRE1/AHK4 being the crucial player involved. Expression analyses showed that the positive effect of CK on developmental transitions relies on the transcriptional activation of MIR172. Using a yeast one-hybrid assay, ARR1, ARR2 and ARR12 were shown to bind to MIR172 promoters, suggesting direct transcriptional activation of MIR172 genes by type-B ARRs. Expression analyses and genetic investigations additionally showed that CK inhibits the expression of the miR172 target gene SMZ which encodes a flowering repressor regulating the expression of the florigenes FT and TSF. As CKs positively regulate TSF, it can be hypothezised that this activation is achieved by inhibition of SMZ.