Untersuchungen zum Einsatz der NEFA und der BHB zur Stoffwechselüberwachung von Transitkühen unter besonderer Berücksichtigung von gepoolten Serumproben

Abstract

Die Stoffwechselüberwachung stellt ein wichtiges Element in der Bestandsbetreuung von Milchviehherden dar. Die Erkennung und das Vermeiden von subklinischen Stoffwechselstörungen stehen dabei im Vordergrund. Zu den häufigsten und ökonomisch bedeutsamsten Stoffwechselstörungen in der Transitperiode zählt die subklinische Ketose (SCK). Diese geht einher mit einem erhöhten Risiko für klinische Erkrankungen, sowie einer verminderten Reproduktions- und Milchleistung. Aus diagnostischer Sicht hat sich die Verwendung der nonesterified fatty acids (NEFA) und der β-Hydroxybuttersäure (BHB) bewährt, um Herden mit SCK als Bestandsproblem zu identifizieren. Dabei kommen Stichprobentestverfahren zur Anwendung. Die Auswertung erfolgt entweder über den arithmetischen Mittelwert einer Stichprobe oder über den Anteil an Tieren in der Stichprobe, die von einem Einzeltierreferenzwert abweichen. In beiden Fällen ist die individuelle Laboranalyse aller Tiere erforderlich. Die hohen Kosten sind einer der Gründe, warum routinemäßige Stoffwechseluntersuchungen nur wenig verbreitet sind. Der Gebrauch von gepoolten Proben stellt eine aussichtsreiche Methode dar, um diese Kosten zu reduzieren. Für die Effizienz und den Erfolg der Untersuchung sind die adäquate Auswahl der zu untersuchenden Tiere, die Probenverarbeitung, eine angemessene Stichprobengröße und die Qualität der Referenzwerte von übergeordneter Bedeutung. Bisher mangelt es an wissenschaftlicher Evidenz und Vertrauen in die Poolproben, so dass dieses Verfahren wenig anerkannt ist. Ziel der Untersuchung war es wichtige präanalytische Einflussgrößen zu untersuchen, die Laktations- und Tagesdynamik der NEFA und der BHB in der Transitperiode zu beschreiben, um letztendlich das diagnostische Potential gepoolter Stoffwechseluntersuchungen zu validieren. Zur Beschreibung der präanalytischen Einflussgrößen wurde in sechs unterschiedlichen Versuchsdurchführungen der Einfluss der Tiefgefrierung, die Lagerungsstabilität von gekühltem und ungekühltem Serum, der Einfluss unterschiedlicher Antikoagulanzien, der Einfluss des Blutprobenentnahmeortes und die Lagerungsstabilität von gekühltem und ungekühltem Vollblut auf die Bestimmung der NEFA und der BHB untersucht. Es wurde bei 46 pluriparen Milchkühen die Laktationsdynamik der NEFA und der BHB in der Transitperiode untersucht. Weiterhin wurden Tagesprofile bei jeweils pluriparen zehn Kühen eine Woche a.p. und eine Woche p.p. durchgeführt. Aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen ergeben sich folgende Empfehlungen: Zur Steigerung der Stabilität sollten die Blutproben nach der Entnahme zeitnah entweder zentrifugiert oder gekühlt gelagert werden. Die Zentrifugation ist als Verfahren zur Konservierung vorzuziehen. Ungekühlte Vollblutproben scheinen eine Lagerungsstabilität von wenigstens 12 Stunden und gekühlte Proben von wenigstens 24 Stunden aufzuweisen. Die Tiefgefrierung von Serum bietet eine längerfristige Möglichkeit zur Konservierung. Die Blutprobenentnahme aus der V. epigastrica cranialis superficialis sollte vermieden werden. Die NEFA und die BHB besitzen eine ausgeprägte Tages- und Laktationsdynamik. Die NEFA erreichten ihr Maximum unmittelbar vor der ersten Futtervorlage und sanken innerhalb von vier bis acht Stunden auf das niedrigste Niveau. Die Konzentrationsunterschiede innerhalb des postpartalen Tagesprofils der NEFA bieten einen Erklärungsansatz für Fehlinterpretationen in der Stoffwechseldiagnostik. Bezogen auf die Laktationsdynamik kam es bei den NEFA zu einem graduellen Anstieg in der letzten Woche a.p. Im Anschluss kam es zu einem exponentiellen Anstieg zum Partus und nur geringgradigen Veränderungen in der ersten Woche p.p. Im Gegensatz dazu erreichte die BHB ihr Maximum vier bis acht Stunden nach der ersten Futtervorlage. Die Konzentrationsunterschiede innerhalb eines Tages waren nicht von klinischer Relevanz. Im Bereich der Transitphase änderte sich die mittlere Konzentration der BHB im antepartalen Zeitraum nicht. Zum Partus sank die BHB auf das niedrigste Niveau. Danach folgte ein kontinuierlicher Anstieg bis zum Versuchsende. Sowohl bei den NEFA als auch bei der BHB gab es allerdings starke tierindividuelle Unterschiede in der Ausprägung der Variation während eines Tages und im Laktationsverlauf. Zur Evaluierung der gepoolten Serumproben wurden 278 Stoffwechseluntersuchungen von Milchviehherden ausgewertet. Dabei wurde in jeder Herde eine Blutprobe von maximal zehn pluriparen Kühen entnommen. In 110 Herden konnte eine Stichprobengröße von n = 10 erreicht werden. Die Tiere waren klinisch unauffällig und befanden sich in der ersten Woche p.p. Neben der individuellen Analyse der Proben wurden auch gepoolte Proben der Stichproben auf den Gehalt an NEFA und BHB untersucht. Bei den 2298 untersuchten Einzeltieren lag die Prävalenz der SCK (BHB ≥ 1,4mmol/l) in der ersten Woche p.p. bei 15,8%. Die lineare Regressionsanalyse und der Bland- Altman-Methodenvergleich ergaben eine hohe Übereinstimmung zwischen dem Poolwert und dem arithmetischen Mittelwert der Stichprobe. Für die NEFA (r = 0,98; p < 0,001) und die BHB (r = 0,98; p < 0,001) ergab sich eine hochsignifikante Korrelation zwischen den beiden Methoden. Die Übereinstimmungsgrenzen betrugen für die NEFA -0,12/+0,13mmol/l und für die BHB - 0,14/+0,15mmol/l. Es existiert eine starke Beziehung zwischen dem Poolwert und der Anzahl an gestörten Einzeltieren in der Stichprobe. Bei der SCK lässt sich eine gleichgerichtete Auslenkung der Stoffwechselparameter innerhalb einer Tiergruppe beobachten. Der Poolwert gibt die Auslenkung der diagnostischen Parameter wieder. Unterschiedliche Verfahren wurden genutzt, um qualitativ hochwertige Referenzgrenzen für gepoolte Stoffwechseluntersuchungen unter Verwendung der NEFA und der BHB zu generieren. Unter der Annahme, dass ein hoher Anteil an Tieren mit erhöhten NEFA und/ oder BHB-Werten in der Frühlaktation das Risiko für Gesundheitsstörungen und Milchleistungsverlusten erhöht, dient der Poolwert von zehn zufällig ausgewählten klinisch gesunden Tieren als kontinuierliches Risikomaß zur Überwachung der Stoffwechselgesundheit in der Transitperiode. Die in dieser Arbeit verwendeten Verfahren zur Festlegung der Referenzgrenzen für die NEFA und die BHB können in Zukunft auch für weitere Laborparameter genutzt werden, um gepoolte Stoffwechseluntersuchungen als anerkanntes Diagnostikum in der Bestandsbetreuung von Milchviehherden zu etablieren.

Metabolic profiling represents a key element for herd health investigations in dairy herds. Though, the detection and prevention of subclinical metabolic diseases has the main priority. Subclinical ketosis (SCK) is one of the most frequent and economic important metabolic diseases in the transition period. SCK is associated with increased risk for clinical diseases, impaired reproductive performance and reduced productivity. Metabolic profiling with nonesterified fatty acids (NEFA) and β- hydroxybutyrate (BHB) has become the mainstay in monitoring dairy herds for SCK. Therefore, random samples are used. Metabolic profile results can be interpreted as either individual mean values of the subgroup sampled or as the proportion of animals above or below a certain cutpoint within the subsample. Both procedures require the analysis of all individual samples. Although the use of metabolic profiling has been widely advocated, their acceptance has been limited as a result of high cost. Pooling samples provides an alternative to reduce laboratory costs. For the efficiency and the success of the pooled sample procedure the adequate sampling, sample handling, sample size and the quality of the reference criteria are most meaningful. However, scientific evidence is missing for accepting the pooled sample procedure. Therefore the objectives of the study were to investigate the effects of different preanalytical procedures and to describe the diurnal and lactational variation of NEFA and BHB for validating the diagnostic potential of a pooled sample metabolic profile. For describing the effects of different preanalytical procedures six experiments were performed to investigate the effect of freeze-thaw, storage temperature and time of serum and whole blood, anticoagulant, blood collection side on the concentrations of NEFA and BHB, respectively. Fortysix pluriparous dairy cows were sampled to describe the dynamics of NEFA and BHB in the transition period. Additionally, the diurnal variation of NEFA and BHB was investigated in ten pluriparous cows in the last week antepartum and the first week postpartum, respectively. Recommendations based on the results of these experiments are: Blood samples should be either centrifugated or kept chilled for improving the storage stability. Centrifugation of blood samples is more important than storage temperature for conservation. Unchilled whole blood samples remain stable for at least 12 hours and chilled samples for at least 24 hours. Freezing serum samples can be used for long-term conservation. Blood sampling from the V. epigastrica cranialis superficialis should be avoided. NEFA and BHB contain a pronounced diurnal and lactational variation. NEFA reached their peak just before the fresh feed was delivered. After four to eight hours the concentrations decreased to the lowest level. Disregarding the diurnal variation in the postpartum period could be a failure source for misinterpretation of metabolic profiles. Based on lactation dynamics of NEFA, there was a gradual increase in the last week antepartum followed by an exponential increase at the time of parturition. Thereafter, small changes were observed in the first week postpartum. In contrast, BHB reached its peak four to eight hours after fresh feed was delivered. The diurnal variation was not of clinical relevance. Based on lactation dynamics of BHB, average BHB concentration did not change antepartum. At the time of parturition BHB decreased to the lowest level and increased continuously until the end of the experiment. However, there were strong individual differences in the shape of the diurnal and lactational variation for NEFA and BHB, respectively. For evaluating the pooled serum samples 278 metabolic profiles were performed. In each herd a maximum of ten pluriparous cows was sampled. In 110 herds a sample size of n = 10 was reached. The animals sampled were clinically healthy and in the first week postpartum. A pooled sample was build by mixing aliquot volumes of the individual sera of each sample. NEFA and BHB concentrations were measured in individual and pooled serum samples. Regarding the 2298 individual animals, the prevalence of SCK (BHB ≥ 1,4mmol/l) was 15.8%. Linear regression analysis and Bland-Altman method comparison revealed a high agreement between the pool value and the arithmetic mean of the sample. There was highly significant correlation between the two methods for NEFA (r = 0,98; p < 0,001) and BHB (r = 0,98; p < 0,001), respectively. The limits of agreement were -0,12/+0,13mmol/l and -0,14/+0,15mmol/l for NEFA and BHB, respectively. There is a strong relationship between the pool value and the number of abnormal animals in the sample. The pool value provides useful information about the deviation of diagnostic metabolites in an animal group with SCK. Different methods were used for generating reference criteria with high quality for a pooled sample procedure with NEFA and BHB. Based on the assumption that having a high proportion of cows with elevated NEFA and/ or BHBA concentrations in the fresh cow group increases the disease risk and the risk of impaired production the pool value of NEFA and BHBA from 10 randomly selected healthy animals in the first week postpartum could be regarded as a continuous measure of risk and provide useful information about the metabolic health of an animal group. The methods proposed in this study for generating reference criteria for pooled serum samples of NEFA and BHB can be used in the future for additional laboratory parameters for establishing the pooled sample metabolic profile as a reliable diagnostic approach for dairy herd health investigations.