Charakterisierung der BTB-MATH Proteinfamilie in Arabidopsis thaliana

Abstract

BTB-Proteine sind definiert durch das hochgradig konservierte Protein-Protein- Interaktionsmotiv BTB/POZ (Bric-a-Brac/Tramtrack/Broad complex/POX Virus and Zink finger), welches oft in Kombination mit anderen Protein- oder DNA- Bindedomänen auftritt. In Pflanzen und Tieren wurde die Assoziation von BTB- Proteinen mit Cullin3 Proteinen demonstriert. Als Untereinheiten multimerer Ubiquitin-Ligasen vermitteln CUL3-BTB Komplexe die Ubiquitinierung von Substratproteinen, wodurch sie regulierend in biologische Prozesse, wie Entwicklung, Zellzyklus und Pathogenantwort eingreifen. Das Arabidopsis Genom kodiert für zwei CUL3 Proteine und etwa 80 BTB-Proteine. Letztere werden nach ihrer Domänen-Komposition in zehn Familien unterteilt. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Arabidopsis BPM (BTB-MATH) Familie umfaßt sechs Mitglieder (61-89 % Identität der Aminosäuresequenzen), die die Fähigkeit zur Homo- und Heterodimerisation besitzen. Neben Interaktionen innerhalb der Familie können BPM1-5 zusätzlich mit CUL3 assoziieren. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, daß die BPM Proteine Substratadapter von modularen Ubiquitin E3-Ligasen mit CUL3 als zentrale Untereinheit sind. Die Aktivität solcher Komplexe mit CUL3- und BPM-Homologen wurde bereits für Säugetiere und Ceanorhabditis elegans gezeigt. Mittels Promotor:GUS Fusionskonstrukten und RT-PCR Analyse wurde die Expression der BPM Gene in verschiedenen Geweben dokumentiert, und die Induktion der Expression einiger Mitglieder durch die Applikation von Salz, Osmotika bzw. Trockenstress aufgezeigt. Lokalisationsanalysen mit GFP Fusionsproteinen ergaben eine Beschränkung der subzellulären Lokalisation der GFP:BPM Proteine auf den Nukleus und/oder das Cytoplasma. Auf der Suche nach Bindungspartnern und potentiellen Substratproteinen von CUL3-BPM E3-Ligasen wurden in zwei Y2H-screens eine Reihe von Transkriptionsregulatoren der ERF/AP2 (Ethylene Response Factor/APETALA2) Genfamilie als Interaktoren der BPM MATH-Domäne identifiziert. Einer dieser ERF/AP2-Transkriptionsfaktoren, RAP2.4 (At1g78080), wurde im Detail analysiert. RAP2.4 bindet spezifisch die MATH- Domäne der BPM Proteine, innerhalb der Familie aber unspezifisch alle Mitglieder. Eine weitere Kartierung der Bindemotive grenzt die interagierenden Proteinbereiche ein, allerdings wurde weder eine Beteiligung der AP2-Domäne an der BPM1/RAP2.4 Bindung ausgeschlossen, noch ein Konsensusmotiv für mehrere BPM Interaktoren identifiziert. Die Assoziation der BPM Proteine mit Vertretern verschiedener AP2-Familien, bei gleichzeitiger Bindungsspezifität innerhalb der RAP2.4-Unterfamilie, spricht jedoch für ein unabhängiges BPM Bindemotiv. EMSA-Experimente ergaben eine Bindung des RD29A Promotors durch RAP2.4 in vitro, wobei kein Einfluß einer Interaktion mit den BPM Proteinen beobachtet werden konnte. Experimente zur Stabilität des Transkriptionsfaktors zeigten außerdem, daß ein schneller Abbau des RAP2.4 Proteins in planta in Abhängigkeit vom 26S Proteasom erfolgt. Beschränkt durch fehlende Nullmutanten wurden rap2.4-1, bpm5-2, sowie während dieser Arbeit generierte asbpm4 antisense Pflanzen mit dem Wildtyp verglichen. Es wurden keine grundsätzlichen Veränderungen in Morphologie oder Entwicklung beobachtet. Die Ergebnisse der Behandlungen mit Phytohormonen, Salz, Osmotika und Trockenstress gaben Hinweise auf einen funktionalen Zusammenhang von BPMs und RAP2.4 im Bereich der Stresstoleranz. In ihrer Gesamtheit unterstützen die erzielten Ergebnisse die Annahme, daß die Funktion der BPM/RAP2.4 Assoziation die Rekrutierung des RAP2.4 Proteins in eine CUL3 E3-Ligase mit anschließender Ubiquitinierung von RAP2.4 ist. CUL3-BPM E3-Ligasen mit ERF/AP2 Transkriptionsfaktoren als Substratproteine würden einen neuen Regulationsmechanismus transkriptioneller Stressantworten darstellen.

The BTB proteins are defined by a highly conserved protein-protein-interaction motif BTB/POZ (Bric-a-Brac/Tramtrack/Broad complex/POX Virus and Zink finger), often combined with a secondary protein- or DNA-binding domain. In plants and animals the association of BTB proteins with Cullin3 proteins was demonstrated. As subunits of multimeric Ubiquitin-ligases CUL3-BTB complexes mediate ubiquitination and subsequent degradation of substrate proteins, and by this regulating diverse biological processes like development, cell cycle and response to pathogens. The Arabidopsis genome encodes two putative redundant CUL3 proteins, called CUL3A and CUL3B, and approximately 80 BTB proteins that are subdivided into 10 families by the composition of their domains. The BTB-MATH (BPM) family, analysed in this work, contains six members (61-89% identity in amino acid sequences) that are capable of forming homo- and heterodimers. Beside the interactions in between the family BPM1-5 can additionally assemble with the CUL3 proteins. These results led to the hypothesis that BPM proteins are substrate adaptors for modular ubiquitin ligases with CUL3 as the central scaffolding subunit. The activity of complexes with CUL3 and BPM-homologes was already shown in mammalia and Ceanorhabditis elegans. Using promoter:GUS fusion constructs and RT-PCR analysis the expression of BPM genes in all tested tissues was documented, and additionally the induction of some of the members by application of salt, osmotics and drought was uncovered. Localisation analysis with GFP fusion proteins showed a restriction of the subcellular localisation of BPM proteins to the nucleus and/or cytoplasm. To search for binding partners and potential substrate proteins of CUL3-BPM E3-ligases two Y2H screens were performed, identifying several transcription regulators of the ERF/AP2 (Ethylene Response Factor/APETALA2) gene family as interactors of the BPM MATH-domain. One of these ERF/AP2 transcription factors, RAP2.4 (At1g78080), was analysed in detail. The protein binds specifically the MATH domain of BPM proteins, but within the BPM family with all members. By further mapping the binding motifs, the interacting areas of the proteins could be narrowed down. However, neither it could be excluded the participation of the AP2 domain, nor a clear consensus sequence for BPM interactors was identified. The assembling of BPM proteins with members of different AP2 families, along with the shown high binding specificity within the subfamily of RAP2.4, argues for an independent BPM binding motif. Using EMSA assays it was demonstrated that RAP2.4 is able to bind the RD29A promoter in vitro and that this interaction is not influenced by assembling with BPM proteins. Moreover the analysis of protein stability of the transcription factor revealed a rapid degradation of RAP2.4 by the 26S proteasome in planta. Restricted by the lack of null mutants in the common seed collections rap2.4-1, bpm5-2 and asbpm4 antisense plants, generated during this project, were compared to wild type plants. No fundamental alterations in development or morphology were observed. Results of diverse treatments with phytohormones, salt, osmotics and drought gave hint to a functional link of BPMs and RAP2.4 in stress tolerance. In summary, the achieved results support the assumption that the function of BPM/RAP2.4 assembling is the recruitment of RAP2.4 to a CUL3-based E3-ligase with subsequent ubiquitination of RAP2.4. CUL3-BPM E3-ligases would constitute a novel regulatory mechanism of transcriptional stress responses.