Investigations into the human immunoglobulin repertoire utilizing high- throughput sequencing

Abstract

The main role of the adaptive immune system is to protect the body against pathogens. Immunoglobulins are an essential part of this system. The great diversity of immunoglobulins is obtained by a complex mechanism of genetic reorganization from a predetermined set of gene segments on chromosomal level and subsequent affinity maturation. Thereby a specific affinity for a particular pathogen is finally achieved. For a successful immune response to occur, the effector functions of the constant region of the immunoglobulin are also essential - which are different in all immunoglobulin classes. The latest innovations in DNA sequencing technology allow nowadays to analyze and evaluate immunological questions in respect to cell-bound (i.e. B-cell receptors) and secreted immunoglobulins from human donors on cDNA level. The technological innovation, which is generally referred to as "next generation sequencing" and especially the so-called pyro-sequencing laid the basis to the present study. The aim was to develop a method for sequencing antibody cDNA by pyro-sequencing, which allows all genes and all immunoglobulin classes to be quantitatively and qualitatively measurable. With this novel approach the immunoglobulin repertoire from peripheral blood samples of healthy donors of different ages and gender ought to be analyzed. The newly developed immunoglobulin specific cDNA amplification method established during this thesis is independent of the use of V-gene specific primers. It further allows the verification of the corresponding immunoglobulin classes and sub-groups in the obtained sequences. Through the introduction of a newly developed emulsion PCR method, the influences of the sample preparation and the cDNA amplification procedure on the representative quality of the obtained sequences were minimized. Furthermore, it was necessary to create a new amplicon processing protocol for the 454 Roche GS FLX sequencer to achieve compatibility with the amplicons generated in the previous antibody amplification process. Using the novel immunoglobulin-amplification and sequencing method, more than 3.5 million sequences were obtained from a representative group of 14 healthy individuals of different age and gender. At first, a comprehensive analysis of the distribution of V(D)J genes in the donor was performed. Some genes, which were not covered in previous studies, could be included in the study and their relative occurrence evaluated. Moreover, for the first time, the VDJ gene distribution in conjunction with their immunoglobulin class has been analyzed. The results of the analyses show that there are differences in the immunoglobulin repertoire of young (19-30 years) and elderly people (> 50 years). A reduction in the ability to change the classes of antibodies is observed and this correlates with age. This is in line with current studies, where the reduction in class switch is discussed as a cause for decreased vaccine efficacy in the elderly population. In this work, it is shown that the influence of age on the ability to change the immunoglobulin classes can be analyzed by cDNA sequencing. The results also strongly suggest that the senescence of the immune system begins in an age range between 50 and 60 years. A correlation between gender and the ability to change the classes of antibodies could, however, not be detected in this study. The developed methods for sequencing immunoglobulin repertoire allow entirely new insights into the immune system. Due to the improved experimental set-up, the complexity of the variables that can be analyzed from a single sample increases considerably. In future, changes of the immune system in healthy and diseased individuals can be measured and analyzed on a new, unrivaled level of complexity. The methods developed during my PhD and the obtained results provide a solid basis for future research addressing the analysis and verification of disease-specific changes in the immune system.

Die wichtigste Rolle des adaptiven Immunsystems ist der Schutz des Körpers vor Pathogenen. Immunglobuline sind ein wesentlicher Bestandteil dieses Systems. Die große Vielfalt von Immunglobulinen wird durch einen komplexen Mechanismus der genetischen Reorganisation aus einem vorgegebenen Satz von Gensegmenten auf chromosomaler Ebene und anschließender Affinitätsreifung erhalten. Dadurch wird letztlich eine spezifische Affinität für ein bestimmtes Pathogen erreicht. Für eine erfolgreiche Immunantwort sind außerdem die Effektor- Funktionen der konstanten Region des Immunoglobulins, die in allen Immunglobulin-Klassen unterschiedlich sind, entscheidend. Die jüngsten Innovationen in der Sequenz-Analyse von DNA erlauben seit kurzem, zellgebundene (B-Zell-Rezeptoren) und sezernierte Immunglobuline von menschlichen Spendern im großen Umfang auf cDNA-Ebene zu sequenzieren und immunologisch zu bewerten. Diese technologischen Innovationen, die generell als „Next-Generation-Sequencing“ bezeichnet werden und speziell die der sogenannten Pyro-Sequenzierung bildeten die Basis der vorliegenden Untersuchung. Ziel war die Entwicklung eines Verfahrens zur Sequenzierung von Antikörpern durch Pyro-Sequenzierung von cDNA, das alle Gene sowie alle Immunglobulin-Klassen quantitativ und qualitativ messbar macht. Dafür sollte das Immunglobulin-Repertoire aus peripheren Blutproben von gesunden Spendern unterschiedlichen Alters und Geschlechts analysiert werden. Die in dieser Arbeit neu entwickelte Immunglobulin-spezifische cDNA-Amplifikationsmethode ist unabhängig von der Verwendung von Primern, die für V-Gene spezifisch sind. Sie ermöglicht zudem die Verifizierung der zugehörigen Immunglobulin-Klassen und ihrer Untergruppen in den erhaltenen Sequenzen. Der Einfluss der Vorbereitung auf die repräsentative Qualität der Proben und deren cDNA- Vervielfältigung wird durch eine entwickelte Emulsions-PCR-Methode minimiert. Des Weiteren war es notwendig, ein neues Amplicon-Aufarbeitungsverfahren für den 454 Roche GS FLX Sequenzer zu erstellen, um Kompatibilität mit den vorangegangenen Schritten der Amplicon-Generierung zu erreichen. Mittels der neuartigen Immunglobulin-Amplifikations- und Sequenzier-Methode konnten aus einer repräsentativen Gruppe von 14 gesunden Individuen unterschiedlichen Alters und Geschlechts mehr als 3,5 Millionen Sequenzen gewonnen werden. Im ersten Schritt wurde eine umfassende Analyse der Verteilung der V(D)J-Genen innerhalb der Spender durchgeführt. Dabei konnten auch Gene, die in früheren Studien nicht abgedeckt wurden, in die Untersuchung einbezogen werden und deren relatives Vorkommen evaluiert werden. Überdies wurde erstmalig die VDJ- Gen-Verteilung im Zusammenhang mit deren Immunglobulin-Klasse analysiert. Das Ergebnis der Analyse zeigt, dass junge (19-30 Jahre) und ältere Menschen (>50 Jahre) sich in Bezug auf ihr jeweiliges Immunglobulin-Repertoir unterschiedlich verhalten. Die Reduktion der Fähigkeit zum Wechsel der Antikörperklassen korreliert mit dem Alter – in aktuellen Untersuchungen wird dies als Ursache für verringerte Impfstoffwirksamkeit bei älteren Menschen diskutiert. In dieser Arbeit wird deutlich, dass der Einfluss des Alters auf die Fähigkeit zum Wechsel der Antikörperklassen durch Immunglobulin- Sequenzierung analysiert werden kann. Die Ergebnisse lassen zudem darauf schließen, dass in einem Alter zwischen 50 und 60 Jahren die Seneszenz des Immunsystems beginnt. Eine Korrelation zwischen Geschlecht und Fähigkeit zum Wechsel der Antikörperklassen konnte in dieser Untersuchung dagegen nicht nachgewiesen werden. Durch die hier entwickelten Verfahren zur Immunglobulin- Sequenzierung ergeben sich ganz neue Erkenntnisse in Bezug auf das Immunsystem. Aufgrund des verbesserten Versuchsaufbaus hat sich die Komplexität an Messgrößen, die aus einer einzigen Probe analysiert werden können, deutlich erhöht. In Zukunft können die Veränderungen des Immunsystems in Gesunden und Erkrankten in einer neuen, vorher unerreichten Komplexität gemessen und analysiert werden. Die im Rahmen meiner Promotion entwickelten Verfahren und die damit erhaltenen Ergebnisse bieten eine solide Grundlage für zukünftige wissenschaftliche Fragestellungen, die der Entdeckung und Verifizierung krankheitsspezifischer Veränderungen des Immunsystems dienen.