Die Rolle der Tryptophan-Hydroxylase 2 bei der Entstehung psychiatrischer Erkrankungen: alternatives Spleißen und RNA-Editierung humaner TPH2-Transkripte

Abstract

Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) ist ein monoaminerger Neurotransmitter, der an zahlreichen Aspekten der Verhaltenskontrolle beteiligt ist. Das serotonerge System nimmt seinen Ursprung in einer handvoll 5-HT synthetisierender Neuronen im Hirnstamm, die zusammen die Raphekerne B1 - B9 bilden. Seit über 40 Jahren ist bekannt, dass die Tryptophan-Hydroxylase (TPH) das geschwindigkeitsbestimmende Enzym in der 5-HT-Biosynthese ist. Erst kürzlich konnte ein zweites TPH-Gen (TPH2) identifiziert werden, das hauptsächlich im Gehirn exprimiert wird, während die Expression des bislang bekannten TPH-Gens (TPH1) vorwiegend in nicht neuronalen Geweben erfolgt. Dysfunktionen des serotonergen Systems im Gehirn konnten mit einer Vielzahl neuropsychiatrischer Erkrankungen, wie Depression, Schizophrenie und Suizidalverhalten in Zusammenhang gebracht werden und umfangreiche Beweise deuten auf TPH2 als Kandidatengen für 5-HT-verwandte psychiatrische Störungen. Zum besseren Verständnis der physiologischen Bedeutung von 5-HT im Gehirn und bei der Ätiologie psychiatrischer Erkrankungen wurde ein induzierbares Mausmodell etabliert. Das Modell basiert auf der spezifischen Expression der E. coli-Nitroreduktase (NTR) in den serotonergen Rapheneuronen und die damit verbundende Metabolisierung des inaktiven Protoxins CB1954 zu einem potenten Zytotoxin, wodurch die Ablation der 5-HT-Neuronen induziert und die zentralnervösen 5-HT-Spiegel konditionell gesenkt werden. Die transgenen NTR1 Mäuse zeigten jedoch trotz spezifischer NTR-Expression keinen Phänotyp nach Behandlung mit CB1954. Die Expression einer gfp markierten NTR in COS7-Zellen zeigte die Aggregation des Fusionsproteins und lies eine beeinträchtigte Translation durch Unterschiede im synonymen Codongebrauch zwischen Donor- und Wirtszelle vermuten. Eine synthetische NTR Version (ntro), deren Codongebrauch an die Präferenzen der Maus angepasst wurde, führte zu höheren Proteinausbeuten in verschiedenen Säugerzelllinien und sensibilisierte diese bereits bei einer zehnfach geringeren CB1954-Konzentration. Die Verbesserung des NTR/CB1954-Systems auf translationeller Ebene sollte sein Potential hinsichtlich der Untersuchung zellulärer Funktionen durch konditionale Zellablation in transgenen Tieren erhöhen und verspricht zusätzlich eine Anwendung in der humanen Krebstherapie durch GDEPT (gene-directed enzyme prodrug therapy). Zahlreiche Studien haben die positive Kopplung von Einzelstrangpolymorphismen (SNPs) im TPH2-Gen mit psychiatrischen Erkrankungen und ihren möglichen Einfluss auf die enzymatische Aktivität der TPH2 gezeigt. In der vorliegenden Arbeit ergab die Sequenzierung von TPH2-cDNAs von post mortem-Gehirnproben des Menschen, dass humane TPH2-Transkripte alternativ gespleißt werden, wobei sich die kinetischen Eigenschaften der kodierten Varianten TPH2A und TPH2B unterscheiden. Zudem werden die prä-mRNAs von TPH2a und TPH2b dynamisch editiert, durch spezifische sich gegenseitig ausschließende Editierungsmuster, die die enzymatische Aktivität der entsprechenden Proteine modulieren. Zusätzlich zur Dichotomie des serotonergen Systems, definiert durch die zwei geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme TPH1 und TPH2, in peripheren bzw. neuronalen Geweben, ermöglicht die TPH2a/b-Editierung eine noch komplexere Feinregulation der zentralen 5-HT-Biosynthese. Letztendlich werden molekularbiologische Beweise präsentiert, die vermuten lassen, dass eine Dysregulation von alternativem Spleißen und RNA Editierung an der Ätiologie psychiatrischer Erkrankungen beteiligt ist. Eine wichtige Schlussfolgerung der hier gezeigten Ergebnisse ist die Tatsache, dass weder die aktuell verwendeten RNA- basierten Techniken noch immunhistochemische Proteinnachweismethoden eine Aussage über die TPH2-Aktivität in der psychiatrischen Forschung erlauben, wodurch die bisherigen Daten zu Störungen der TPH2-Expression bei psychiatrischen Erkrankungen sorgfältig nachgeprüft werden sollten.

Serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) is a monoaminergic neurotransmitter involved in multiple facets of behavioral control. The serotonergic projection system has its roots in a handful of selectively 5-HT-synthesizing neurons within the brainstem, which altogether constitute the raphe nuclei B1 - B9. It is known since more than four decades that tryptophan hydroxylase (TPH) is the rate-limiting enzyme in the 5-HT biosynthesis. Recently, a second TPH gene (TPH2) was identified, which is mainly expressed in the brain, whereas the previously known TPH gene (TPH1) is predominantly expressed in non-neuronal tissues. Dysfunctions of the serotonergic system in the brain have been implicated in a variety of neuropsychatric disorders, like depression, schizophrenia and suicidal behaviour and overwhelming evidence points to TPH2 as a candidate gene for 5- HT-related psychiatric disorders. In order to better understand the physiological role of 5-HT in the brain and the etiology of psychiatric diseases a mouse model was established. The model is based on the specific expression of the E. coli nitroreductase (NTR), which is associated with the bioactivation of the inactive prodrug CB1954 to a powerful cytotoxin in the serotonergic raphe neurons. This leads to the ablation of the 5-HT neurons, thereby conditionally decreasing the 5-HT levels in the CNS. In spite of specific expression of NTR in the 5-HT neurons the transgenic NTR1 mice did not respond to CB1954. The expression of a gfp tagged NTR in COS7 cells showed the aggregation of the corresponding fusion protein, suggesting impaired translation by divergent synonymous codon usage between the donor and host cell. A synthetic NTR version (ntro), in which codon usage was adapted to mouse preferences, showed higher expression levels in different mammalian cell lines rendering them more sensitive to the prodrug CB1954 by one order of magnitude. The improvement of the NTR/CB1954 system at the translational level should increase its potential for the investigation of cellular functions by conditional targeted cell ablation in transgenic animals. Moreover, the ntro developed in this study is a promising candidate for human cancer treatment by GDEPT (gene-directed enzyme prodrug therapy). Numerous studies have proven positive linkage of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the TPH2 gene with psychiatric diseases and their possible influence on TPH2 enzymatic activity. By sequencing TPH2 cDNAs from human post mortem brain samples it could be shown that TPH2 exists in two alternative splice variants with distinct kinetic properties of the encoded TPH2A and TPH2B proteins. Further, the pre-mRNAs of TPH2a and TPH2b are dynamically edited in a mutually exclusive pattern, which modulates the enzymatic activity of the respective proteins. Thus, in addition to the dichotomy of the serotonergic system defined by the two rate limiting enzymes, TPH1 and TPH2, in peripheral and neuronal tissues, respectively, TPH2a/b editing allows an even more complex fine tuning of the central nervous 5-HT biosynthesis. Finally, molecular biological evidence is presented suggesting that a deregulated alternative splicing and RNA editing might be involved in the etiology of psychopathological diseases. An important implication of the results is the fact that neither currently used RNA-based techniques nor immunohistochemical protein detection methods allow estimating the enzymatic activity of TPH2 in psychiatry research. Thus, the here presented data should invite for careful reexamination of present reports on TPH2 expression disturbances in psychiatric disease.