Charakterisierung der Guanosindeaminase von Arabidopsis thaliana und Evaluation ihrer Bedeutung für den Purinnukleotidabbau

Abstract

Für die vollständige Freisetzung des gebundenen Stickstoffs aus den Purinnukleotiden sind verschiedene Reaktionen notwendig. Dazu gehören die Dephosphorylierung der Nukleotide, die Hydrolyse der dabei entstehenden Nukleoside sowie die Deaminierung und Oxidation der Nukleobasen (Zrenner et al., 2006). Die erste gemeinsame Zwischenstufe im Abbau aller Purinnukleotide ist die Nukleobase Xanthin. Dieser Metabolit kann in Pflanzen durch schrittweise Oxidation und Hydrolyse des Purinrings vollständig zu Glyoxylat, Kohlendioxid und Ammoniak abgebaut werden (Werner et al., 2010; Werner und Witte, 2011). Durch Reassimilation des Ammoniak in Aminosäuren wird der zuvor in den Nukleotiden gebundene Stickstoff wieder nutzbar. Während der Abbau des Purinringsystems in Arabidopsis thaliana, ausgehend von Xanthin, vollständig aufgeklärt ist, ist über den Katabolismus der Nukleotide zu Xanthin und die daran beteiligten Enzyme ist bislang nicht sehr viel bekannt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung einer, am Abbau von Guanosinmonophosphat beteiligten, Deaminase. Zu Grunde lag dabei die Hypothese, die Deaminierung des Guanylrestes werde in A. thaliana, wie bei vielen anderen Organismen, durch eine Guanindeaminase katalysiert. Durch Sequenzvergleiche, basierend auf den Proteinsequenzen bekannter Guanindeaminasen, konnte ein entsprechendes Kandidatenprotein identifiziert werden. Erste biochemische Analysen des Proteins zeigten jedoch nicht das vermutete Ergebnis. Es wurde keine Guanindeaminaseaktivität beobachtet. Bei einem Test verschiedener Verbindungen konnte das Nukleosid Guanosin als das Substrat der Deaminase identifiziert werden. Eine solche Enzymaktivität wurde zwar bereits vereinzelt beschrieben, jedoch wurde bislang kein Gen identifiziert, das die genetische Information eines entsprechenden Proteins kodiert. Dies gelang nun erstmals im Rahmen dieser Arbeit. Im weiteren Verlauf wurde die Guanosindeaminase (GSDA) unter anderem hinsichtlich ihrer enzymkinetischen Eigenschaften, der subzellulären Lokalisation sowie des Expressionsprofils in der Pflanze untersucht. Metabolitanalysen von gsda- Mutanten zeigten, dass das Enzym auch in vivo für die Deaminierung von Guanosin verantwortlich ist. Dabei wurde ebenfalls deutlich, dass 2’-Deoxyguanosin, welches in vitro als Substrat akzeptiert wurde, in der Pflanze nicht durch die GSDA deaminiert wird. Der Phänotyp der gsda-Mutanten bei anhaltender Dunkelheit lässt Rückschlüsse auf einen Zusammenhang zwischen dem Purinnukleotidabbau und dem Kohlenhydrathaushalt von A. thaliana zu. Ausgehend von öffentlich verfügbaren Genexpressionsdaten, werden ein möglicher Kohlenhydratmangel in den gsda-Mutanten und dessen Auswirkungen auf das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze diskutiert. Die Rolle der GSDA im Purinnukleotidabbau wurde mithilfe von Metabolitanalysen genauer untersucht. Dabei wurden neben gsda-Mutanten auch Doppelmutanten analysiert, denen zusätzlich zur GSDA ein weiteres Enzym dieses Stoffwechselweges fehlte. Diese Experimente zeigten werden, dass der Abbau von XMP linear über GMP und Guanosin zu Xanthosin verläuft. Basierend auf diesen Ergebnissen wird die Bedeutung der GSDA für den Stickstoffexport aus den Knöllchen bestimmter Leguminosen sowie für die Purinalkaloidsynthese in Kaffee, Tee und Kakao diskutiert.

Several reactions are required to release the nitrogen that is bound in purine nucleotides completely. This involves nucleotide dephosphorylation, hydrolysis of the corresponding nucleosides as well as deamination and oxidation of the purine bases (Zrenner et al., 2006). The first common intermediate in the degradation pathway of all purine nucleotides is the base xanthine. Plants can fully degrade this metabolite to glyoxylate, carbon dioxide and ammonia by successively oxidizing and hydrolyzing the purine ring (Werner et al., 2010; Werner und Witte, 2011). Reassimilation of ammonia into amino acids makes the nitrogen that was bound in nucleotides available for the metabolism. Whereas the degradation of xanthine has been described completely, little is known about the catabolism leading from the nucleotides to xanthine and the enzymes that are involved. This thesis addresses the characterisation of a deaminase involved in the catabolism of guanosine monophosphate. It is based on the hypothesis that, as in many organisms, the deamination of the guanyl group is catalyzed by a guanine deaminase in Arabidopsis thaliana. Sequence alignments using known guanine deaminases as query were employed to identify a suitable candidate protein. First biochemical analyses did not show the suspected results. Guanine deaminase activity could not be detected. By testing different compounds the nucleoside guanosine was identified as substrate for deamination. An enzymatic activity like this has been observed occasionally, but no gene coding for the respective protein was identified so far. In this thesis such a gene is described for the first time. Within the progress of this work the guanosine deaminase (GSDA) was characterized regarding its kinetic properties, subcellular localization and expression profile in different plant tissues. Metabolite analyses of gsda-mutants could prove the enzyme’s in vivo-function in guanosine deamination. They also showed that deamination of 2’-deoxyguanosine is not catalyzed by the GSDA in the plant although this reaction has been observed in vitro. The phenotype that the gsda-mutants show when grown in prolonged darkness hints towards a connection between purine nucleotide catabolism and the plant’s carbohydrate metabolism. Based on publically available gene expression data a probable lack of carbon in the gsda-mutants and its consequences concerning growth and development are discussed. The GSDAs role in purine nucleotide catabolism was investigated in detail using metabolite analyses. Besides single mutants different double mutants were examined that lacked the GSDA as well as a second enzyme of this pathway. Those experiments could show that there is a linear degradation of XMP leading to xanthosine via GMP and guanosine. Based on those results the significance of the GSDA for nitrogen export from the nodules of certain legumes as well as for purine alkaloide synthesis in coffee, tea and cocoa is discussed.