dc.contributor.author
Lamla, Thorsten
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:09:00Z
dc.date.available
2002-12-10T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11533
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15731
dc.description
#### Titelblätter
#### Inhaltsverzeichnis
#### 1\. Einleitung 1
#### 2\. Zielsetzung 17
#### 3\. Methoden 18
#### 4\. Ergebnisse 48
#### 5\. Diskussion 97
#### 6\. Zusammenfassung 110
#### 7\. Literaturverzeichnis 112
#### 8\. Anhang 118
dc.description.abstract
Das überaus große Interesse an der Identifikation von Protein-Protein
Wechselwirkungen gipfelte bereits Mitte der 80er Jahre mit dem 'Phage Display'
in einem ersten Selektionssystem. Die Anfang der 90er Jahre aufkommende
Methode zur in vitro Selektion von Nukleinsäuren, welche die schnelle
Generierung von Aptameren und Ribozymen ermöglicht, verdeutlichte die enormen
Vorteile und Möglichkeiten eines in vitro Systems, die von den zur Verfügung
stehenden Bibliotheken mit bis zu 1016 verschiedenen Molekülen herrühren. Da
Proteine im Gegensatz zu Nukleinsäuren eine größere Palette an strukturellen
und katalytischen Eigenschaften in der Biologie bereitstellen und wesentlich
intensiver in der Diagnostik, Therapie und bei industriellen Applikationen
verwendet werden, bestand großes Interesse in der Entwicklung von Methoden zur
in vitro Selektion von Proteinen. Ein Ende der 90er Jahre entwickelter Ansatz
ermöglicht die in vitro Selektion und Evolution von Proteinen durch Kopplung
des Genotyps, in Form der mRNA, mit dem Phänotyp, in Form des Proteins und
erhielt den Namen 'Ribosome Display'. Diese Arbeit beschreibt die Selektion
streptavidinbindender Peptide, sowie die Entwicklung der dafür benötigten
Technologien. Streptavidin wurde als Zielmolekül ausgewählt, da eine Vielzahl
von kommerziell erhältlichen Streptavidinkonjugaten eine breite Anwendung in
den Biowissenschaften finden. Basierend auf einem zellfreien, prokaryontischen
Translationssystem erfolgte die Etablierung des 'Ribosome Display' anhand
eines Modellsystems, dessen Grundlage erstmals kein Antikörper, sondern ein
His-tag, also ein einfaches Affinitätspeptid war. Es wurden zwei Nukleinsäure
kodierte Peptidbibliotheken generiert, wobei der randomisierte Anteil in einem
Fall aus 16 NNS-Codons besteht und die 'Loopstruktur' des Chymotrypsin-
Inhibitors 2 aus dem Gerstenkorn kodiert. Die zweite Bibliothek umfaßt 15 NNS-
Codons und kodiert den N-Terminus des fettsäurebindenden Proteins (FABP) aus
Rinderherz. Aus der kombinatorischen FABP-Bibliothek konnten mit Hilfe des
'Ribosome Display' nach sieben in vitro Selektionsrunden streptavidinbindende
Peptide isoliert werden. Klonierung und Sequenzierung ergaben eine Reihe
unterschiedlicher Peptide, die sich im wesentlichen in zwei Gruppen
unterteilen ließen. Bei der größeren Gruppe handelt es sich um Peptide mit
einem HPQ-Motiv, das bereits aus anderen Arbeiten bekannt ist. Bei der anderen
Gruppe handelt es sich um völlig neuartige Peptide, die am N-terminus ein
DVEAW-Motiv aufweisen. Aus dieser Gruppe geht der beste Binder mit der Sequenz
DVEAWLDERVP-LVET und einem Kd-Wert von etwa 84 nM hervor, der sich zudem
hervorragend als Affinitätspeptid zur Aufreinigung rekombinanter Proteine
eignet.
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de
dc.description.abstract
The great interest in the identification of protein-protein interactions
culminated in the first selection system which was phage display in the middle
of the eighties. Beginning of the nineties a method for the in vitro selection
of nucleic acids was introduced, which enables the rapid generation of
aptamers and ribozymes and highlighted the enormous advantages and
possibilities of an in vitro system stemming from the large initial libraries
with up to 1016 different members. Because proteins in contrast to nucleic
acids carry out a wider range of structural and catalytic roles in biology and
are much more extensively used in diagnostic, therapeutic, and industrial
applications, great interest has been generated in the development of methods
for the in vitro selection of proteins. At the end of the nineties a method
for the in vitro selection and evolution of proteins was developed and
designated ribosome display. This work describes the selection of
streptavidin-binding peptides and the development of the required
technologies. Streptavidin was chosen as target molecule, because a large
number of commercial available streptavidin-conjugates is widely used in the
field of life science. A cell-free, prokaryotic translation system was the
basis for establishing the ribosome display technique and took place with help
of a model system. For the first time such a model system was based on a
simple affinity tag, namely His-tag and not an antibody. Two nucleic acid
encoded peptide libraries had been generated. The random portion of the one
library consisted of 16 NNS-codons and encodes the loopstructure of the
chymotrypsin inhibitor 2 from barley seeds. The other library contained 15
NNS-codons and encodes the N-terminus of the fatty acid binding protein (FABP)
from bovine heart. It was possible to isolate streptavidin-binding peptides
from the combinatorial FABP-library after seven rounds of in vitro selection.
Cloning and sequencing revealed a number of different peptides which could be
divided in two groups. The larger group involves peptides with a HPQ-motif
which is known from other selections. The other group involves totally new
peptides with a DVEAW-motif at their N-terminus. Out of this group the best
binder evolves with the sequence DVEAWLDERV-PLVET and a Kd value of about 84
nM. This peptide is outstandingly suitable as an affinity peptide for the
purification of recombinant proteins.
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en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
cell-free translation
dc.subject
in vitro selection
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
In vitro Selektion streptavidinbindender Peptide
dc.contributor.firstReferee
Professor Volker Erdmann
dc.contributor.furtherReferee
Professor Hans Lehrach
dc.date.accepted
2002-11-26
dc.date.embargoEnd
2002-12-11
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002002819
dc.title.translated
In vitro selection of streptavidin binding peptides
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000761
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/281/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000761
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dcterms.accessRights.openaire
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