Morbus Crohn: Mechanismen der epithelialen Barrierestörung und der therapeutische Effekt von TNFα-Antikörpern

Abstract

Durch Wechselstrom-Impedanzanalysen an Biopsien aus dem Colon sigmoideum konnte eine Störung der epithelialen Barriere bei M. Crohn gezeigt werden. Diese Barrierestörung ist für die Pathophysiologie des Morbus Crohn von Bedeutung, da sie die Antigenaufnahme in die Lamina propria erleichtert und somit den Entzündungsprozess kontinuierlich stimuliert. Als mögliche Ursachen einer epithelialen Barrierestörung wurden die epitheliale Apoptoserate sowie die Expression von Tight junction-Proteinen untersucht. Die epitheliale Apoptoserate bei M. Crohn war im Vergleich zur Kontrolle mehr als verdoppelt. Da gezeigt wurde, dass Einzelzellapoptosen insbesondere unter Entzündungsbedingungen mit einer Erhöhung der Leitfähigkeit des Epithels einhergehen, ist davon auszugehen, dass die Zunahme epithelialer Apoptosen bei M. Crohn erheblich zur Barrierestörung beiträgt. In Western-Blot-Analysen zeigte sich eine verminderte Expression der abdichtenden Tight junction- Proteine Occludin und Claudin-3, die mit einer Expressionserhöhung des porenbildenden Tight junction-Proteins Claudin-2 einherging. Elektronenmikroskopisch spiegelten sich diese Veränderungen in einer Verringerung der Anzahl von Tight junction-Strängen mit Verminderung der Tiefe des Tight junction-Netzwerkes sowie in einem diskontinuierlichen Aspekt der Tight junction-Stränge wider. Da sowohl die beobachteten Expressionsveränderungen von Tight junction-Proteinen als auch die damit einhergehende Morphologie in Zellkulturexperimenten mit einer Permeabilitätserhöhung einhergingen, ist ein Beitrag dieser Veränderungen zur Barrierestörung bei M. Crohn anzunehmen. Zur Untersuchung des Effektes einer TNFa-Antikörpergabe auf die epitheliale Barrierestörung bei M. Crohn wurden in einem zweiten Teil der Arbeit Biopsien aus dem Colon sigmoideum von M. Crohn- Patienten vor und 2 Wochen nach einer Einmalgabe von Infliximab untersucht. Zwei Wochen nach TNFa-Antikörpergabe zeigte sich eine Verbesserung der epithelialen Barrierefunktion die mit einer Verminderung der epithelialen Apoptoserate bei unveränderter Expression der Tight junction-Proteine Occludin, Claudin-1 und Claudin-4 einherging. Um herauszufinden, ob eine alleinige Reduktion der Apoptoserate die beobachtete Zunahme des epithelialen Widerstandes erklären kann, wurden in einem Zellkulturmodell selektiv Apoptosen induziert und der Effekt der Apoptoseerhöhung auf den transepithelialen Widerstand gemessen. Eine Zunahme der Apoptoserate um 2,8% führte dabei zu einer Widerstandsabnahme um 40%. Der Vergleich mit den nach TNFa-Antikörper-Therapie erhobenen Daten zeigte eine Reduktion der Apoptoserate um 2,4%, die mit einer Widerstandszunahme von 42% einherging. Dieser Vergleich zeigt, dass die Verbesserung der Barrierefunktion unter TNFa- Antikörper-Therapie möglicherweise durch eine alleinige Reduktion der epithelialen Apoptoserate ohne Einfluss auf die Tight junction hervorgerufen sein könnte.

In this work an analysis of the epithelial barrier dysfunction in Crohn's disease (CD) was performed and the effect of a TNFa antibody treatment on intestinal barrier function in CD was examined. Alternating current impedance analysis of biopsies from sigmoid colon of CD patients revealed a disturbed epithelial barrier function. This finding is important since the barrier dysfunction facilitates the uptake of antigens to the lamina propria thus stimulating the inflammatory process in CD. Epithelial apoptoses and expression of tight junction proteins were examined as possible structural correlates for the epithelial barrier dysfunction. Epithelial apoptosis was shown to more than doubled in CD patients compared to controls. It has to be assumed that the increase in epithelial apoptosis contributes significantly to the barrier disturbance in CD since it was shown that single cell apoptosis leads to an increased epithelial conductivity, in particular under inflammatory conditions. Western blot analysis revealed a downregulated expression of the sealing tight junction proteins occludin and claudin-3, while expression of the pore-forming tight junction protein claudin-2 was upregulated. These findings were paralled by a decrease in the number of horizontal tight junction strands and a decreased depth of the main tight junction meshwork in freeze fracture electron microscopy of CD biopsies. Moreover, tight junction strands of CD patients showed a discontinuous morphology which is characteristic for a high expression of claudin-2. It has to be supposed that these alterations contribute to the epithelial barrier dysfunction in CD, since the observed changes in tight junction protein expression as well as the alterations of tight junctions in freeze fracture replicas were shown to result in an increased epithelial permeability in cell culture experiments. To investigate the effect of a TNFa antibody treatment on the epithelial barrier function in CD, biopsies of sigmoid colon from CD patients were examined before and 2 weeks after treatment with infliximab. Epithelial barrier function was improved two weeks after TNFa antibody treatment. This barrier restitution was paralleled by a decrease in epithelial apoptoses, while expression of the tight junction proteins occludin, claudin-1 and claudin-4 was unchanged. To investigate wether the changes in epithelial apoptotic ratio are sufficient to explain the increase in epithelial resistance, apoptosis was induced in an intestinal cell culture and the resulting changes in epithelial resistance were measured. In these experiments an increase in apoptotic ratio by 2.8% resulted in a decrease of epithelial resistance by 40%. In comparison, the data of the TNFa antibody treatment showed a decrease in epithelial apoptotic ratio by 2.4% which was paralleled by an increase in epithelial resistance by 42%. This indicates that epithelial barrier restitution under TNFa antibody treatment may be the result of a sole reduction in epithelial apoptoses.