Analyse der Transkriptionsregulation von LMO2: Ein T-Zell Onkogen und essentieller hämatopoetischer Faktor

Abstract

Das LMO2-Gen ist an der Entwicklung nahezu aller hämatopoetischen Linien, insbesondere der erythroiden Linie, involviert. Mindestens zwei verschiedene Promotoren (P1 und P2) werden für die Regulation des Gens postuliert. In dieser Dissertation wurde die erythroid-spezifische Transkriptionsregulation von LMO2 über P1 mittels Electrophoretic mobility shift assays, Reportergen- Assays und Kartierung von DNaseI hypersensitiver Stellen (DHS) analysiert. Zusätzlich wurden alternative Transkripte identifiziert und eine DHS- Kartierung im Bereich des putativen P2 in erythroiden, lymphoiden und embryonalen Nierenzellen durchgeführt. Sequenzanalysen lieferten, zusätzlich zu den bereits bekannten Bindestellen für GATA1 und SP1 am Transkriptionsstart, sechs weitere mögliche Bindestellen für GATA1, eine CCAAT-Box und eine E-Box. Eine nicht-linienspezifische (DHS2) und vier erythroid-spezifische DHS (DHS1, 3, 4, 5) sind identifiziert worden. DHS1 wurde unmittelbar am Transkriptionsstart lokalisiert. In vitro hat GATA1 DNA- Fragmente, die GATA1-Bindestellen aus dem Bereich der DHS1, DHS3, DHS4 und DHS5 enthielten, gebunden. Welche Faktoren an der erythroid-spezifischen Regulation von LMO2 beteiligt sind, wurde mittels Reportergen-Assays in nicht- erythroiden NIH3T3-Zellen untersucht. Expressionsvektoren für GATA1, SP1 und FOG1 (Friend of GATA) wurden mit Promotor P1-Konstrukten co-transfiziert. Ein Wildtyp-Konstrukt, das zwei intakte GATA1- und eine SP1-Bindestelle enthält und ein Mutanten-Konstrukt, in dem beide GATA1-Bindestellen inaktiviert wurden zeigten keine Aktivität in NIH3T3-Zellen. Co-Transfektion von GATA1-Expressionsvektor führte zur 4-5-fachen Aktivierung des Wildtyp-P1-Konstruktes, während das Mutanten-P1-Konstrukt nicht aktiviert wurde. SP1 zeigte eine geringe Aktivierung. GATA1 ist für die erythroid- spezifische Regulation von LMO2 verantwortlich. Synergistische Effekte zwischen GATA1 und SP1 in der Regulation von LMO2 waren nicht zu beobachten, während die Ergebnisse der Reportergen-Assays auf eine Kooperation zwischen GATA1 und FOG1 hinweisen. Durch Sense-/Decoy-Experimente mit Phosphothioat- Oligonukleotiden in HEL-Zellen wurde GATA1 in vivo abgefangen und eine Expressionsänderung von LMO2 im Northern Blot untersucht. Eine sehr geringe Änderung der LMO2-Expression war mit dem Wildtyp-Oligo nachweisbar. Alternative Transkripte (LMO2c und LMO2d) wurden in fötaler Leber beobachtet, sie codieren wahrscheinlich für kein Protein und ihre biologische Aktivität ist fraglich. DNaseI hypersensitive Stellen konnten im Bereich des putativen P2 in erythroiden, lymphoiden und embryonalen Nierenzellen nicht kartiert werden.

The LMO2 gene is involved in the development of nearly all hematopoietic lineages, especially the erythropoietic lineage. Two different promoters (P1 and P2) were postulated for the gene. The erythroid specific regulation of the LMO2 transcription via P1 was analysed in this thesis with EMSAýs (Electrophoretic mobility shift assays), reporter gene assays and DNaseI hypersensitive sites (DHS) mapping. Additionally alternative transcripts were identified and DHS mapping for the putative P2 were performed in erythroid, lymphoid and embryonal kidney cells. Sequence analysis identified six GATA1 binding sites, a CCAAT-box and an E-box, additionally to the known GATA1 and SP1 sites very close to the transcription start. One non-specific site (DHS2) and four erythroid specific sites (DHS1, 3, 4 and 5) were found. DHS1 is located very close to the transcription start. GATA1 bound in vitro DNA- fragments from the mapped erythroid DHS sites, containing GATA binding sites. The factors involved in the erythroid specific regulation of LMO2 were analysed by reporter gene assays in non-erythroid NIH3T3 cells. Expression vectors for GATA1, SP1 and FOG1 (Friend of GATA1) were co-transfected with the promoter P1 constructs. A wildtype construct with two GATA1 and one SP1 site and a mutant construct, where both GATA1 binding sites were inactivated showed no activity in NIH3T3 cells. The wildtype construct was activated 4-5 fold by co-transfection with GATA1 expression vector, but not the mutant construct. SP1 leads to a weaker activation. GATA1 was identified as the erythroid specific regulator of LMO2. Synergistic effects between GATA1 and SP1 in the regulation of LMO2 was not observed. In contrast, a co-operation between GATA1 and FOG1 may be possible from the results of the reporter gene assays. Sense/Decoy experiments with phosphorothioate oligonucleotides (PTO) in HEL cells were used to study the control of the LMO2 expression. LMO2 expression was analysed after PTO addition by northern blots. A small reduction of the LMO2 expression was detected with wildtype PTOs. New alternative transcripts (LMO2c and LMO2d) were found in fetal liver, but they do not encode a protein and their biological activity is unknown. DHS sites in the region, where the putative P2 is expected, could not be identified in erythroid, lymphoid and fetal kidney cells.