Interaktion zwischen der SH3-Domäne des humanen Endophilins und möglichen Interaktionspartnern: Expression und isotherme Titrationskalorimetrie

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit sollte festgestellt werden, ob sich die isotherme Titrationskalorimetrie als Methode eignet, um Interaktionen zwischen der SH3-Domäne des Endophilin-1 und 30 möglichen Interaktionspartnern (Faupel 2004) bzw. der sogenannten Lim-Domäne, einem Abschnitt des „cystein- und glycinreichen Proteins 2“, nachzuweisen. Die Untersuchung von Interaktionen erfolgte in mehreren Schritten: Bei den möglichen Interaktionspartnern handelt es sich um Proteine, die zunächst darauf überprüft wurden, ob sie sich in einer Menge exprimieren und aufreinigen ließen, die für eine Messung am ITC ausreicht. Dies traf auf die folgenden Proteine zu: „programmed cell death 6 interacting protein“, „heterogenous nuclear ribonuclearprotein A1“, „microtubuleassociated protein 1 light chain 3A“, „hypothetical protein FLJ21610“ und das „Rho-GTPase aktivierende Protein“. Somit wurden diese Proteine, die SH3-Domäne und zwei Abschnitten des „cystein- und glycinreichen Proteins 2“ exprimiert und mittels Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) und Gelfiltrations-Chromatographie (GFC) aufgereinigt. Darauf folgten die Messungen am isothermen Titrationskalorimeter. Die Messungen ergaben, dass die isotherme Titrationskalorimetrie durch vier Faktoren in ihrer Anwendbarkeit für den Nachweis von Interaktionen zwischen der SH3-Domäne und möglichen Interaktionspartnern eingeschränkt wird. Bei diesen Faktoren handelt es sich um die benötigte Proteinmenge, die Dauer einer Messung am Kalorimeter, die Stabilität der Proteine und die Größe der Wärmesignale.

The objective of the presented work was to investigate whether the Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a useful method to identify interaction partners of the SH3 domain of human Endophilin-1. For this purpose 30 putative interaction partners were selected based on previous screening experiments. After optimization of expression and purification six proteins were isolated in sufficient amounts, namely (i) the "programmed cell death 6 interacting protein", (ii) the "heterogeneous nuclear ribonuclearprotein A1", (iii) the "microtubule associated protein 1 light chain 3A", (iv) the "hypothetical protein FLJ21610", (v) the "Rho-GTPase activating protein", and (vi) the "cystein und glycin rich protein-2". The interaction of these proteins with the purified SH3 domain of human Endophilin-1 was then studied by ITC. Under the conditions of the experiments for none of the proteins examined a specific interaction could be detected. Taken together, the results of this work indicate that the Isothermal Titration Calorimetry is suitable to only a limited extent for screening protein-protein interactions.