Experimentelle Untersuchung zur Rolle der angeborenen Immunantwort und der Wirtsspezifität von Salmonella enterica Serovaren

Abstract

Salmonellen sind bedeutende Zoonoseerreger und führen zu schweren Infektionskrankheiten sowohl beim Menschen als auch beim Tier. In der vorliegenden Arbeit wurden vergleichende Salmonella-Invasionstudien mit jeweils zwei bereits etablierten Zellarten (Epithel und Makrophagen) aus je drei verschiedenen Wirtsystemen (Schwein, Maus, Mensch) durchgeführt. Hierzu wurden sowohl wirtsadaptierte als auch nichtwirtsadaptierte S. enterica spp. enterica Serovare (S. Typhimurium, S. Choleraesius, S. Dublin und S. Enteritidis) genutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Infektionsversuchen gezeigt, dass die wirtsadaptierten Serovare ein verlangsamtes Wachstum und eine verminderte Invasivität in dem entsprechenden Wirtssystem aufwiesen, wie S. Choleraeuis in porcinen Zellen und S. Typhimurium in murinen Zellen. Darüber hinaus zeigte die PMA-Aktivierung von Makrophagen einen deutlichen Einfluss auf die Invasivität und die intrazelluläre Vermehrungsrate der vier Salmonella-Serovare. Ein infektionsbedingter Zellverlust konnte in dieser Arbeit nach 24h p. i. nur durch S. Typhimurium Infektion, nicht jedoch bei einer Infektion mit S. Choleraesuis beobachtet werden. Somit war der Zelluntergang serovarspezifisch. S. Typhimurium zeigte darüber hinaus in murinen Makrophagen und S. Choleraesuis in porcinen Zellen das Bildnis ruhender oder sich nur schlecht vermehrender intrazellulärer Erreger, dies wiederum trägt zur systemischen Verbreitung des Erregers im Wirt bei. Somit war die intrazelluläre Überlebensrate der Salmonellen hingegen wirtsspezifisch und nicht serovarabhängig, dies zeigte sich durch den Vergleich zweier Untersuchungsmethoden (KbE und GFP). Um diesen Wirt-Erreger-Zusammenhang näher zu beleuchten, wurden NF-κB-Aktivierungsversuche durchgeführt. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass die wirtsspezifischen bzw. wirtsadaptierten Serovare gegenüber den nicht-wirtsadaptierten Erregern eine verminderte Luciferaseaktivität aufwiesen (S. Choleraesuis in porcinen Zellen und S. Typhimurium in murinen Zellen). Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die bakterielle Zellwand im Vergleich zum LPS ein stärkerer NF-κB-induzierender Faktor ist und dass S. Typhimurium die zelleigene Immunantwort des Wirtes minimieren konnte. Diese ermittelten Ergebnisse zeigten, dass Gastroenteritisauslösende Salmonellen wie die nicht-wirtsadaptierte Serovare S. Enteritidis oder S. Typhimurium (Mensch, Schwein) über eine schnellere intrazelluläre Vermehrungsrate und über eine hohe NF-κB-Antwort ihre eigene Eliminierung durch das Wirtsimmunsytem fördern. Die wiederum Septikämie- auslösenden Erreger wie S. Choleraesuis (Schwein) und S. Typhimurium (Maus) führten in den Zellen zu einer geringeren immunologischen Zellantwort und zu einem geringen intrazellulären Wachstum. Dies ermöglicht den Erregern, die Immunabwehrmechanismen des Wirtes zeitweise zu umgehen und fördert eine effektivere Verbreitung der Erreger im Wirtsorganismus. Die Fähigkeit der Erreger, systemisch zu streuen, ist somit auch direkt verknüpft mit deren Fähigkeit, in Makrophagen eines bestimmten Wirtes zu überleben. So gesehen sind mononukleäre Phagozyten eines Wirtes eine essentielle Barriere und Bestandteil der Wirtspezifität der Salmonella-Serovare. Da der Wirt einen essentiellen Einfluss auf den Ausgang einer Infektion besitzt, wurden im zweiten Teil dieser Arbeit die porcinen NOD-Proteine der angeborenen Immunantwort untersucht, um damit eine Grundlage für weitere wissenschaftliche Arbeiten auf dem Gebiet der Salmonellenwirtsspezifität zu schaffen. Die erhobenen Daten zeigten, dass porcines NOD höhere Homologien mit dem humanen NOD als humanes NOD mit dem murinen NOD besitzen. Darüber hinaus zeigte die LRR-Domäne Unterschiede zwischen der porcinen NOD1-Sequenz und der humanen NOD1-Sequenz, dies lässt eine Wirtsspezifität auf der Ebene der PGN-Detektion vermuten. Darüber hinaus zeigte die LRR-Domäne von NOD zwischen zweier Schweinerassen SNPs auf, was auf eine verstärkte Variabilität der PRR in der Schweinepopulation hinweist. Diese Sequenzunterschiede könnten ein bedeutender Faktor sein, bei der Resistenzentwicklung oder der Empfindlichkeit bestimmter Rassen auf Krankheiten. Weiterführende Arbeiten zum Zusammenspiel der NOD- Proteine wird Erkenntnisse nicht nur hinsichtlich der bakteriellen Wirtszellantwort geben, sondern auch Möglichkeiten des pharmakologischen Modulierens bieten.

Salmonella serovars are important zoonotic pathogens, and can cause severe infections in both humans and animals. In the study presented here, comparative in vitro infection studies were performed in two, established cell types (epithelia and macrophage) derived from three different host species origins (porcine, murine and human). Both host-adapted and broad host-range S. enterica spp. enterica serovars (S. Typhimurium, S. Choleraesius, S. Dublin und S. Enteritidis) were used for the infection studies. In this study, it was shown that the host-adapted serovars showed reduced growth and invasion of the pertinent host cells, e.g. S. Choleraesuis in porcine host cells and S. Typhimurium in murine host cells. In addition, it was shown that phorbol myristic acid (PMA) activation of macrophage results in large effects on the invasion and intracellular growth of the four Salmonella serovars. A Salmonella infection-dependent host cell loss was found to occur 24 hours post-infection only for S. Typhimurium-infected cells but not for S. Choleraesuis, indicating that the induction of host cell death was serovar- specific. Furthermore, the observation that S. Typhimurium and S. Choleraesuis showed static or poor intracellular growth in murine and porcine host cells, respectively, coupled with the known systemic proliferation of these serovars in their respective host species suggests a correlation of this growth characteristic contributing to systemic infections. That the intracellular survival of the Salmonella serovars is host-specific and not serovar-dependent was shown by comparison of two different methodologies (CFU and GFP). In order to clarify this host-pathogen interaction more closely, studies on the activation of host cell NF-κB in response to infections were carried out. In this work it was found that host-restricted or hostadapted serovars showed reduced lucifearse activation of their respective host cells compared to the broad host-range serovars. In addition, it was shown that the bacterial cell wall was a much more potent activator of NF-κB as compared to LPS, and that S. Typhimurium was capable of minimizing the host cell´s immune response. These results indicate that gastroenteritis-causing Salmonella such as the non-host- adapted or broad hostrange serovars S. Enteriditis or S. Typhimurium which have a more rapid intracellular growth rate and a higher NF-κB response in human and porcine hosts, contribute to their own elimination through the host immune system. Serovars causing septicemia such as S. Choleraesuis or S. Typhimurium in porcine and murine hosts, respectively, showed low intracellular growth and reduced host cell immune responses. It is suggested that this latter observation permits the pathogens to evade (at least for a short time) the host immune response, allowing a more effective dissemination of the pathogen in the host. However, the ability for the pathogen to spread systemically is also directly related to its ability to surivive within the macrophage of a particular host. The mononuclear phagocytes (macrophage) of the host therefore play an essential role as both barrier and component of the host-specificity of Salmonella serovars. Since the host also plays an essential role on the outcome of an infection, in the second half of this work, the porcine NOD proteins involved in the innate immune response were also investigated in order to provide a basis for future research on Salmonella host specificity. The data show that the porcine NOD proteins show a much higher homology with the human NOD proteins than the human NOD proteins show to murine NOD proteins. In addition, the LRR domains of the porcine NOD1 protein showed differences compared to the human NOD1, suggesting the recognition of PGN might play a role in host-specificity. Furthermore, the LRR domains among two different crosses of swine also showed single nucleotide polymorphisms (SNPs), possibly indicating variability among the swine populations. These sequence differences might represent an important factor involved in resistance or sensitivity to infections. Future work concerning the interplay between the NOD proteins could provide additional information not only with regard to the host cell response to bacteria, but also provide possibilities for pharmacological modulation of this response.