Nachweis monoklonaler Umlagerungen der Beta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Gens mittels einer neu entwickelten Polymerase-Kettenreaktion in Verbindung mit der GENESCAN-Technik

Abstract

T-Zell-Lymphome treten in verschiedenen klinischen und histologischen Erscheinungsformen auf, die ihre Abgrenzung von nicht-malignen T-Zell Lymphoproliferationen häufig schwierig macht. Der Nachweis klonaler T -Zellrezeptor-Umlagerungen bietet für diese Unterscheidung eine wichtige Hilfestellung, da maligne T-NHL sich immer durch eine klonale T-Zellpopulation mit identischen T-Zellrezeptor-Umlagerungen auszeichnen. Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung einer neuen Methode zum Nachweis klonaler T-Zellrezeptor-Umlagerungen. Hierfür wurden 13 neue Jb- Primer generiert, die zusammen mit einem modifizierten Vb-Primer eingesetzt wurden. Darüber hinaus wurde für die Analyse der entstandenen PCR-Produkte ein neues automatisiertes Trennverfahren (GENESCAN) etabliert und angewendet, das in der Lage ist, PCR-Produkte bis auf ein einziges Basenpaar zu unterscheiden. Schließlich wurde das neu entwickelte TCR-b PCR-Verfahren mit einem bestehenden TCR-g Verfahren verglichen. In einer großen Vergleichsstudie mit 132 Proben von 62 Patienten mit verschiedenen T-Zell-Lymphomen- bzw. Leukämien konnten wir mittels der familienspezifischen TCR-b PCR in 61/62 der Fälle (98,4 %) eine monokonale TCR-b Umlagerung nachweisen. Zusätzlich konnte der identische T-Zellklon in 15/18 korrespondierenden regionären Lymphknoten und in 7/11 Blutproben detektiert werden. Im Gegensatz hierzu zeigte die TCR-g PCR eine T-Zell- Klonalität lediglich in 50/62 (80 %) Patienten sowie in 63 % der Lymphknoten und 44 % der Blutproben. Die Ergebnisse zeigen, daß die neue TCR-b PCR in der Lage ist, praktisch alle klonalen T-Zellpopulationen nachzuweisen. Da dieser Nachweis nicht auf qualitativ hochwertige DNA beschränkt ist, sondern auch bei in Paraffin- eingebettetem Gewebematerial gleiche Ergebnisse liefert, ist das hier beschriebene Verfahren allen anderen bisher eingesetzten Methoden überlegen. Damit stellt die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und etablierte TCR-b PCR eine echte Alternative zu den bisher verwendeten Nachweismethoden dar.

The distinction between benign polyclonal and malignant monoclonal lymphoid disorders by morphology or immunophenotyping is frequently difficult. Therefore, the demonstration of clonal B-cell or T-cell populations by detecting identically rearranged immunoglobulin (Ig) or T-cell receptor (TCR) genes is often used to solve this diagnostic problem. Whereas the detection of rearranged Ig genes is well established, TCR g (gamma) and b (beta) gene rearrangements often escape detection with the currently available polymerase chain reaction (PCR) assays. To establish a sensitive, specific, and rapid method for the detection of rearranged TCR-b genes, we developed a new PCR approach with family-specific Jb primers and analyzed the resulting PCR products by high-resolution GeneScan technique. The superior efficiency of this new method was demonstrated by investigating 132 DNA samples extracted from lymph node and skin biopsy specimens (mostly formalin fixed) and blood samples of 62 patients who had a variety of T-cell lymphomas and leukemias. In all but 1 of the tumor samples (98.4%) a clonal amplificate was detectable after TCR-b PCR and the same clonal T-cell population was also found in 15 of 18 (83%) of the regional lymph nodes and in 7 of 11 (64%) of the peripheral blood samples. Direct comparison of these results with those obtained currently by the most widely applied TCR-g PCR revealed an approximate 20% lower detection rate in the same set of samples than with the TCR-b PCR method. These results indicate that the new TCR-b PCR is most suitable for a rapid and reliable detection of clonal T-cell populations.