dc.contributor.author
Fischer, Andreas
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:07:23Z
dc.date.available
2007-07-18T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11493
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15691
dc.description
Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Literaturverzeichnis
dc.description.abstract
Die kleinen GTPasen der Rho-Familie nehmen eine zentrale Stellung im
Signaltransduktionsnetz der Zelle ein und sind an der Regulation des Aktin-
Zytoskeletts sowie an der Steuerung von Transkription, Proliferation,
Differenzierung und Membrantransportprozessen beteiligt. Dies wird durch die
Aktivierung verschiedener Effektorproteine vermittelt, deren genaue Rolle im
Rho-Signaltransduktionsweg jedoch bislang auf Grund des Fehlens relevanter in
vivo Modelle häufig unbekannt ist. Zur funktionellen Charakterisierung eines
dieser Effektormoleküle, der Serin/Threonin-Kinase PKN, wurde ein Tiermodell
analysiert, in dem eine konstitutiv aktivierte Form dieses Moleküls unter
Kontrolle des MMTV-LTR-Promotors in den Brustdrüsen transgener Mäuse
exprimiert wurde. Mit Hilfe von Northern Blot Hybridisierungen, RT-PCR, in
situ Hybridisierung und Immunpräzipitationstechniken konnte dabei in zwei
unabhängigen Linien die Expression der konstitutiv aktivierten Proteinkinase N
im Mammaepithel nachgewiesen werden, wobei sich eine maximale
Transgenexpression während der Laktation fand. Jungtiere, die von transgenen
Müttern gesäugt wurden, zeigten eine signifikante Wachstumsretardierung, die
durch Austauschexperimente auf eine verminderte Laktationskompetenz transgener
Weibchen zurückgeführt werden konnte. Als morphologisches Korrelat konnte in
konventionell-histologischen und Ganzorganpräparaten von Brustdrüsen ein
Ausbleiben der alveolären Expansion am Beginn der Laktation mit luminaler
Akkumulation eines viskösen Sekretionsprodukts gezeigt werden. Dabei fanden
sich zwischen transgenen Tieren und Kontrollweibchen keine signifikanten
Unterschiede in der Expression der Milchproteine WAP, beta-Casein, WDNM und
alpha-Laktalbumin; ultrastrukturell und immunhistochemisch stellte sich jedoch
alveolär eine luminale und intrazelluläre Milchproteinretention dar, die im
weiteren Verlauf der Laktation zu einem progredienten Verlust epithelialen
Gewebes mit einem lipomatösen Umbau des Drüsenkörpers führte. Dies konnte
durch Nachweis einer erhöhten Apoptoserate sowie der verstärkten Expression
von TGF-beta 3 und IGFBP5 als vorzeitiges Einsetzen des physiologischen
Involutionsprozesses charakterisiert werden. Weiterhin konnte durch Injektion
radioaktiv markierter Saccharose in den Milchgang laktierender Weibchen in
transgenen Tieren eine erhöhte Permeabilität des Mammaepithels nachgewiesen
werden, die jedoch auf ultrastruktureller Ebene nicht von Auffälligkeiten der
tight junction Morphologie begleitet waren. Die mit den Zonulae occludentes
assoziierten Proteine ZO-1 und Occludin zeigten eine regelrechte Lokalisation,
wobei sich für ZO-1 eine fokale Signalverbreiterung darstellte. Um einen
direkten Effekt der Proteinkinase N auf die tight junction Permeabilität zu
untersuchen, wurden murine EpH4-Mammaepithelzellen mit der konstitutiv
aktivierten Proteinkinase N stabil transfiziert. Auch hier zeigte sich eine
signifikante Beeinträchtigung der hydrocortison-induzierten tight junction
Versiegelung ohne Occludin- oder ZO-1-Dislokation. Zusammenfassend wird die
Hypothese formuliert, dass PKN als RhoA- und Rac1-Effektormolekül an der
Regulation der parazellulären Permeabilität beteiligt ist und eine Störung der
tight junction Versiegelung am Beginn der Laktation in der murinen Brustdrüse
zu einer vorzeitigen Induktion der Involution führt.
de
dc.description.abstract
The Rho-family of small GTPases plays a pivotal role within the cellular
signal transduction network and is implicated in the regulation of the actin
cytoskeleton as well as in the activation of transcription and the regulation
of cell proliferation, differentiation and membrane trafficking. These effects
are mediated by a variety of downstream effector molecules, yet because of a
lack of relevant in vivo models, the precise role of many of these molecules
remains incompletely understood. To elucidate the function of PKN, an
ubiquitously expressed serin/threonin kinase acting downstream of the small
GTPases RhoA and Rac1, transgenic animals expressing a constitutively
activated form of this molecule under the regulation of the MMTV-LTR promoter
in their mammary glands were analyzed. By employing Northern Blot
hybridization, RT-PCR, in situ hybridization and immunoprecipitation
techniques, the expression of the constitutively activated PKN was confirmed
within the mammary epithelium in two independent transgenic lines with a
maximum expression during lactation. Pups suckled by transgenic mothers
displayed significant growth retardation reflecting impaired lactational
competence in PKN transgenic females as confirmed by cross foster experiments.
Histological sections as well as whole mount preparations revealed that
transgenic alveoli had failed to expand at the onset of lactation and a
thickened secretion product was observed within the alveolar lumina in these
animals. Expression of the milk proteins WAP, beta-casein, WDNM and alpha-
lactalbumin was not altered at the onset of lactation in transgenic animals,
however, by employing electron microscopy as well as immunohistochemistry, a
luminal and intracellular retention of milk proteins was demonstrated in the
mammary gland of these mice that resulted in a progressive loss of epithelial
tissue over the course of lactation that resembled changes seen during
involution. This was further supported by demonstrating an increase in
apoptosis as well as increased expression of TGF-beta 3 and IGFBP5, two genes
previously associated with mammary gland involution, therefore suggesting
precocious involution in PKN transgenic mice. In addition, paracellular
permeability was increased within the mammary epithelium in PKN transgenic
females at the onset of lactation as confirmed by injection of radio labeled
sucrose into the milk duct. Mammary tight junctions displayed no morphological
abnormalities when assessed by transmission electron microscopy and
immunohistochemistry demonstrated the presence of both ZO-1 and occludin at
the apical intercellular contacts with ZO-1 displaying a focally broadened
staining pattern.To investigate whether the increased paracellular
permeability in PKN transgenic mice is the result of a direct action of PKN or
rather reflects a secondary effect, EpH4 mammary epithelial cells were
employed as an in vitro experimental system. Again, tight junction sealing in
response to hydrocortisone was severely impaired in EpH4 cells stably
transfected to express constitutively activated PKN without displacement of
ZO-1 or occludin from the cell membrane. In conclusion, it is hypothesized
that PKN acts downstream of RhoA and Rac1 to modulate paracellular
permeability and that failure of mammary tight junctions to seal at secretory
activation results in precocious involution in the mammary gland.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Signaltransduktion
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Funktionelle Charakterisierung des Rho-Effektormoleküls PKN in einem
transgenen Mausmodell
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. F. Theuring
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. F.-D. Böhmer
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. med. H.-D. Royer
dc.date.accepted
2007-09-23
dc.date.embargoEnd
2007-07-05
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000003102-4
dc.title.translated
Functional characterization of the Rho effector molecule PKN in a transgenic
mouse model
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000003102
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2007/488/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000003102
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access