Entwicklung und Einsatz von 16S rRNA Gensonden zur Identifizierung biotechnologisch genutzter Laktobazillen-Stämme der L. acidophilus- und der L. casei-Gruppe

Abstract

Aufgrund zahlreicher erwünschter Stoffwechselleistungen werden Laktobazillen- Kulturen seit langem als Starterkulturen im Lebensmittel-bereich, als Futterzusatzstoffe in der Tierernährung und als Therapeutika in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Vertreter der L. acidophilus- und der L. casei-Gruppe werden in zunehmendem Maße als Probiotika in Lebensmitteln eingesetzt, wodurch sich die Notwendigkeit einer sicheren und möglichst schnell durchführbaren Identifizierung ergibt. Die klassischen mikrobiologischen Methoden der Identifizierung bis zur Spezies-Ebene erfordern meist einen hohen Zeitaufwand und liefern aufgrund unterschiedlicher Stammformen innerhalb einer Spezies nicht immer eindeutige Ergebnisse. Dabei bereitet innerhalb der L. (= Lactobacillus) acidophilus-Gruppe insbesondere die Differenzierung zwischen L. crispatus und L. gasseri bzw. L. johnsonii und L. acidophilus Schwierigkeiten. In der L. casei-Gruppe ist es durch Änderungen der taxonomischen Einstufung von Spezies zu einer beträchtlichen Verwirrung gekommen. Ziel dieser Arbeit war es daher, für die Spezies L. acidophilus, L. gasseri und L. johnsonii (L. acidophilus-Gruppe) und für L. zeae, L. paracasei und L. rhamnosus (L. casei-Gruppe), gleichzeitig die am häufigsten eingesetzten Spezies in Probiotika, Gensonden zu entwickeln und auf ihre Aussagekraft im Vergleich zu anderen molekularbiologischen Methoden zu prüfen. Hierzu wurden die über das Internet zugänglichen Gendaten und die Computerprogramme des NCBI/GenBank (National Center for Biotechnology Information) sowie des RDP (Ribosomal Database Project) der Michigan State University, USA, genutzt. Die Synthese der L. gasseri-Sonde erfolgte nach partieller Sequenzierung der 16S rRNA eines L. gasseri-Referenzstammes (ATCC 19992 / DSM 20077) mit der PCR-Technik. Zur Prüfung der Eignung der Sonden wurden insgesamt 85 Typ- und Sammlungsstämme aus der L. acidophilus- und L. casei-Gruppe (Typ- / Referenzstämme, Isolate aus Milchprodukten, aus pharmazeutischen Präparaten und aus klinischem Material) sowie vergleichend Vertreter von sieben anderen Lactobacillus-Spezies und zwei Weissella-Spezies herangezogen. Alle Prüfstämme waren vorher mit klassischen phänotypischen Methoden auf ihre Einstufung überprüft worden. Die molekularbiologische Prüfung erfolgte anhand der Dot Blot-Hybridisierungstechnik. Die Hybridisierungsergebnisse zeigten, daß Gensonden zur Speziesidentifizierung von biotechnologisch genutzten Laktobazillen dieser beiden Gruppen eingesetzt werden können. Alle geprüften Stämme der Spezies L. acidophilus sensu stricto wurden nur von der L. acidophilus-Sonde erfaßt. Bei den eng verwandten Spezies L. gasseri und L. johnsonii kam es zu Kreuzreaktionen, d.h. die L. johnsonii- Stämme reagierten zusätzlich mit der L. gasseri-Sonde. Die Abgrenzung zwischen diesen beiden Spezies gelang durch die L. johnsonii-Sonde, da diese lediglich mit den L. johnsonii-Stämmen hybridisierte. Der L. casei-Typstamm (ATCC 393T) reagierte sowohl mit der L. paracasei- als auch mit der L. zeae-spezifischen Sonde. Drei weitere als L. casei deklarierte Stämme hybridisierten lediglich mit der L. paracasei-Sonde, wie auch drei L. paracasei-Referenzstämme und ein weiterer als L. paracasei deklarierter Sammlungsstamm. Das veranlaßte zu einer Unterteilung der L. casei-Stämme in zwei Untergruppen (L. casei I bzw. II). Dieser Befund unterstützt einen gegenwärtigen taxonomischen Lösungs-vorschlag für die L. casei-Gruppe, wonach der jetzige Typstamm von L. casei der Spezies L. zeae zugeordnet werden soll, während die anderen L. casei-Stämme (inklusive des von mehreren Autoren vorgeschlagenen Neo-Typstammes ATCC 334) mit L. paracasei zusammengeführt werden können. Auch unter den phänotypisch als L. rhamnosus identifizierten Stämmen gab es zwei Abstufungen in den Reaktionen. Etwa die Hälfte der Stämme (12) reagierte nur mit der L. rhamnosus-Sonde, die andere Hälfte (10) aber gleichzeitig mit der L. paracasei-Sonde. Die letzteren waren bis auf eine Ausnahme alle klinischen Ursprunges. Aufgrund dieser Kreuzreaktionen wurde eine Einteilung in die Untergruppen L. rhamnosus I bzw. II vorgenommen. Die L. rhamnosus-Sonde kann dennoch als Spezies-spezifisch angesehen werden. Einen Sonderfall stellte ein phänotypisch als L. rhamnosus identifizierter klinischer Stamm dar, der lediglich mit der L. paracasei-Sonde reagierte. Dieser Stamm wurde aber auch in einer anderen mittels RAPD-PCR durchgeführten Untersuchung als L. casei / L. paracasei identifiziert. Mitreaktionen von anderen Spezies aus der L. acidophilus-Gruppe (L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum) sowie von einigen anderen Vertretern der Milchsäurebakterien (Lactobacillus und Weissella) traten nicht auf. Der Vergleich der Ergebnisse, die mittels Gensondentechnik erzielt werden konnten, mit denen, die zuvor mit anderen molekularbiologischen Methoden mit den gleichen Stämmen gewonnen werden konnten bestätigte, daß die Gensondentechnik aussagekräftig für die Einstufung von Stämmen ist. Da die Abgrenzung der bei Mensch und Tier zur autochthonen Mikroflora gehörenden Spezies L. gasseri von L. crispatus mit phänotypischen Untersuchungs-methoden Schwierigkeiten bereitet und Vertretern dieser Spezies im Rahmen der Anwendung als Probiotika eine besondere Bedeutung zukommt, ist die Anwendung zusätzlicher Gensonden erforderlich. Die Herstellung und Prüfung einer L. crispatus-Sonde war im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Ein durchgeführter BLAST- Sequenzvergleich (NCBI/GenBank) des L. gasseri-Typstammes mit dem L. crispatus-Typstamm zeigte aber zwei für eine Gensonde in Betracht kommende Basensequenzabschnitte auf, die eine Differenzierung mit der in dieser Arbeit angewandten Methodik ermöglichen könnten. Hinsichtlich des Arbeitsaufwandes wies die Gensondentechnik Vorteile gegenüber anderen molekularbiologischen Methoden, z.B. der RAPD-PCR-Technik, auf. Nachteilig bei der bisherigen Technik war, daß die Kulturen angezüchtet werden mußten und erst anschließend das Dot Blot-Verfahren eingesetzt werden konnte. Eine Beschleunigung des Nachweises ist von der Reverse Dot Blot-Hybridisierungs-technik zu erwarten, bei der eine Kultivierung der nachzuweisenden Bakterien nicht erforderlich ist und das jeweilige Zielgen durch spezifische Primer vor der Hybridisierung amplifiziert wird und dadurch lediglich kurze Hybridisierungszeiten (2 bis 4 Stunden) erforderlich sind. Die Hybridisierungstechnik ist also zur sicheren Identifizierung einiger biotechnologisch wichtiger Laktobazillen-Spezies geeignet. Weitere Sonden, insbesondere für die Spezies L. crispatus und L. casei/L. paracasei müssen geprüft werden. Auch die Eignungsprüfung dieser Methode in der Routine steht noch aus. Auf Grund der Ergebnisse mit Sammlungsstämmen, die aus Handelsprodukten stammten, wird aber von der Einsatzfähigkeit in der Routine ausgegangen.

Development and application of 16S rRNA-targeted gene probes for the identification of biotechnologically used Lactobacillus-strains of the L. acidophilus- and L. casei-group Due to numerous desirable metabolic properties lactobacilli have long been used as starter cultures in food production, as feed additives in animal nutrition, and as therapeutic agents in the pharmaceutical industry. Members of the L. acidophilus- and the L. casei-group are increasingly applicated as probiotics in food, thus requiring reliable and fast identification. The classical microbiological methods for identification of microorganisms to the species-level are usually tedious and sometimes provide ambiguous results due to varying strain forms within a species. In particular, the differentiation within the L. (= Lactobacillus) acidophilus- group, e.g. between L. crispatus and L. gasseri resp. between L. johnsonii and L. acidophilus may be difficult. In the L. casei-group modifications in the taxonomic classification of species have caused considerable confusion. Therefore, the intention of this study was the development of gene probes for the species L. acidophilus, L. gasseri, and L. johnsonii (L. acidophilus- group), and for L. zeae, L. paracasei, and L. rhamnosus (L. casei-group), which are commonly used as probiotics. Furthermore, the significance of gene probes was to be evaluated in comparison to other molecular methods. For this purpose the databases and computer programs of the NCBI/GenBank (National Center for Biotechnology Information) as well as the RDP (Ribosomal Database Project) of the Michigan State University, USA, which can both be accessed via internet, were utilized. The synthesis of the L. gasseri-probe was performed with the PCR-technique after partial sequence analysis of the 16S rRNA-gene of a L. gasseri-reference strain (ATCC 19992 / DSM 20077). For the validation of the probes a total of 85 type- and reference strains out of the L. acidophilus- and the L. casei-group (type- / reference strains, isolates from dairy products, pharmaceutical preparations, and clinical material) as well as comparatively seven strains from other Lactobacillus-species and two Weissella-species were included. With regard to their classification, all tested strains were previously subjected to classical phenotypical testing. The molecular-based testing was performed by dot blot-hybridization. The hybridization results demonstrated that gene probes can be applied for species-specific identification of biotechnologically used lactobacilli of these two groups. All tested strains belonging to the species L. acidophilus sensu stricto were exclusively detected with the L. acidophilus-probe. Cross- reactions occurred with the phylogenetically closely related species L. gasseri and L. johnsonii, i.e. some strains reacted additionally with another probe, which was not intended for the identification of the respective species. Thus, the L. gasseri-probe also detected the L. johnsonii-strains. Differentiation between these two species was possible by addtionally applying the L. johnsonii-probe, which only hybridized with the L. johnsonii-strains. The type strain of L. casei (ATCC 393T) reacted with the L. paracasei-probe as well as with the L. zeae-specific probe. Three additional strains, which were declared as members of L. casei, hybridized solely with the L. paracasei-probe as well as three L. paracasei-reference strains and one additional collection strain, which was declared as belonging to L. paracasei. This induced a (sub-) division of the L. casei-strains into two subgroups (L. casei I resp. II). These findings support a present proposal for the solution of the taxonomic problems within the L. casei-group, e.g. that the current L. casei-type strain is to be assigned to L. zeae, whereas other L. casei-strains (including strain ATCC 334 suggested as the neo-type strain of L. casei by several authors) may be grouped with L. paracasei. Two gradations with respect to the hybridization reactions also appeared among strains phenotypically identified as L. rhamnosus. Approximately half of these strains (12) reacted only with the L. rhamnosus-probe, the other half (10) however reacted simultaneously with the L. paracasei-probe. All but one of the latter strains where of clinical origin. Due to these cross-reactions the assignment into the subgroups L. rhamnosus I resp. II was carried out. The L. rhamnosus-probe can nevertheless be regarded as species-specific. A special case was represented by a clinical strain phenotypically identified as L. rhamnosus, which reacted solely with the L. paracasei-probe. In other investigations, this strain was also identified as L. casei / paracasei by means of RAPD-PCR. Cross-reactions with other species out of the L. acidophilus-group (L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum) as well as with other representatives of lactic acid bacteria (Lactobacillus and Weissella) did not occur. The comparison of the hybridization results with those obtained in previously performed investigations with other molecular methods with the same strains, confirms the significance of gene probes for the classification of strains. The delimitation of L. gasseri from L. crispatus proves difficult with phenotypic methods. Both species belong to the autochthonous microflora and have special relevance in the context of their use as probiotics. Due to this fact, the application of additional gene probes is required. Although the synthesis and verification of a L. crispatus-probe was not feasible in the scope of these investigations, a comparison of L. gasseri and L. crispatus type strain- sequences retrieved by a BLAST-analysis (NCBI/GenBank) displayed two nucleotide segments, which could achieve a differentiation with the methodology used in this study. Regarding the required work load, the hybridization-technique indicated advantages in comparison to other molecular- based methods, e.g. RAPD-PCR-technique. An unfavourable aspect of the technique applied hitherto was the fact that the dot blot procedure could be used only after having cultured the strains. Faster identification can be expected by the reverse dot blot-hybridization technique, where cultivation of strains prior to hybridization is not necessary and amplification of the target genes with specific primers requires hybridization periods of only 2-4 hours. The hybridization technique is thus suitable for the reliable identification of some biotechnologically relevant Lactobacillus-species. Further probes, in particular for the species L. crispatus and L. casei/paracasei must be developed and validated. The applicability of these methods in the routine is still pending. However, on the basis of the results with collection strains originating from commercial products, the suitability for routine application can be expected.