Non-coding RNA response of human monocyte-derived macrophages during mycobacterial infection

Abstract

Non-coding RNAs are a class of RNAs that generally do not code for any protein. Different types of ncRNAs are present in mammalian cells including miRNA and lncRNAs. miRNAs are small ncRNA containing about 22 nucleotides. They regulate post-transcriptional gene expression by a mechanism that is known as "RNA interference". lncRNAs are relatively large RNAs with a length of more than 200 nucleotides and have various functions such as carrying out both gene inhibition and gene activation through diverse mechanisms. miRNAs have been shown to have a role in mycobacterial pathogenesis; however, little is known about lncRNAs in mycobacterial infection. Mycobacteria are intracellular pathogens that are hard to eradicate because of their ability to inhibit phagolysosome formation. Approximately onethird of the global population is affected by mycobacterial infections. Nothing was known about involvement of lncRNAs and miRNAs in phagosomal maturation upon mycobacterial infection. In the present study, following infection of monocyte derived macrophages with BCG, expression of lncRNAs as well as miRNAs were studied at different time points of incubation. Time points for RNA isolation were selected based on two aspects: Colocalisation studies of the phagosomal marker protein LAMP1 with BCG, and cascades of TLR4 signalling, which occurs in the initial period of mycobacterial infection. Differences in LAMP1 localisation on the phagosomes of both groups were observed at 30 min and 4 h. In the first part of the work, after establishing a lncRNA-based RT-qPCR protocol, several preselected lncRNAs that had functions related to immunity were observed to be downregulated at 30 min in BCG infected macrophages compared to non-infected cells as well as heat-killed controls. Among all of them, MEG3 was a highly downregulated lncRNA. In silico analysis predicted that MEG3 had functions in mTOR and PI3K-AKT signalling pathways suggesting its role in autophagy. Induction of autophagy with IFN-γ in infected macrophages resulted in sustained MEG3 downregulation and lack of IFN-γ allowed for counter-regulation of MEG3 by viable BCG. Knockdown of MEG3 in macrophages resulted in induction of autophagy and enhanced eradication of intracellular BCG. In the second part of the work, a bottom up approach was used to identify miRNAs and respective targets that are involved in phagosomal maturation processes in mycobacterial infection. In silico analysis sorted most enriched miRNAs, and expression studies identified downregulated miRNAs (miR-3619-5p, miR-637 and miR-324-3p) at different time points in BCG infected cells (irrespective of viable or HK BCG) compared to non-infected cells. After identifying their targets, expression studies showed upregulation of lysosomal cysteine protease Cathepsin S (CTSS) and Rab11 family-interacting protein 4 (RAB11FIP4). Reporter gene assays verified regulation of CTSS by miR-3619-5p. Finally, downregulated miR-3619-5p affected autophagy in macrophages. In conclusion, the present study has identified a role of lncRNA MEG3 in mycobacterial infection, as well as that of miRNA miR-3619-5p along with its target CTSS. Both ncRNAs had functions in autophagy-related pathways during mycobacterial infection.

Nicht-kodierende RNAs gehören zu einer Gruppe RNAs, die nicht für Proteine kodieren. In Säugerzellen befinden sich verschiedene Arten nicht-kodierender RNAs, wie z.B. miRNAs und lncRNAs. MiRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, ihre Länge umfasst ca. 22 Nukleotide. Sie regulieren post-transkriptionell die Genexpression über einen Mechanismus, der als “RNA-Interferenz“ bezeichnet wird. LncRNAs sind lange nicht-kodierende RNAs. Sie bestehen aus mehr als 200 Nukleotiden und haben verschiedene Funktionen wie z.B. Hemmung aber auch Aktivierung von Genen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass miRNAs in der Pathogenese mykobakterieller Infektionen eine wichtige Rolle spielen, wohingegen über die Beteiligung von lncRNAs sehr wenig bekannt ist. Mykobakterien sind intrazelluläre Pathogene. Durch ihre Fähigkeit die Phagosomenreifung zu unterbinden, können sie in Makrophagen überleben. Ungefähr ein Drittel der Weltbevölkerung ist infiziert. Die Beteiligung von lncRNAs und miRNAs am Vorgang der Phagosomenreifung wurde bisher nicht untersucht. In der vorliegenden Studie wurden Makrophagen mit BCG infiziert und die Expression von lncRNAs und miRNAs zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert. Die Zeitpunkte für die RNA-Isolation wurden basierend auf Co- Lokalisationsexperimenten von LAMP1 (einem phagosomalen Marker) und BCG ausgewählt. Unterschiede der LAMP1 Lokalisation auf Phagosomen beider Gruppen wurden bei 30 min und 4 h festgestellt. Im ersten Teil der Arbeit wurden lncRNAs untersucht, von denen bekannt ist, dass sie in der Immunantwort von Makrophagen eine Rolle spielen. Mittels RT-qPCR konnte nachgewiesen werden, dass einige dieser lncRNAs in BCG-infizierten Makrophagen 30 Minuten nach der Infektion herabreguliert waren (im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen sowie hitzeinaktivierten BCG-infizierten Zellen). Von allen getesteten lncRNAs war MEG3 am stärksten herabreguliert. Eine in silico Analyse ergab, dass MEG3 in der mTOR und PI3KAKT Signalkaskade involviert ist und daher eine Rolle bei der Autophagy spielen könnte. Eine Induktion von Autophagie durch IFN-γ in infizierten Makrophagen resultierte in anhaltender MEG3 Herabregulation. Ein Knockdown von MEG3 in Makrophagen resultierte in der Induktion von Autophagie und verstärkter Eliminierung intrazellulärer BCG. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein „bottom up“-Vorgehen gewählt, um miRNAs und Zielgene zu identifizieren, die im Prozess der Phagosomenreifung eine Rolle spielen. Eine zunächst durchgeführte in silico Analyse identifizierte die am stärksten involvierten miRNAs. Anschließende Expressionsstudien ergaben, dass die miRNAs miR-3619-5p, miR-637 und miR-324-3p in BCG infizierten Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen herabreguliert waren. Eine Analyse der Expression potentieller Zielgene ergab, dass CTSS (lysosomal cysteine protease S) und RAB11FIP4 (Rab11 family-interacting protein 4) heraufreguliert waren. Eine Regulation von CTSS durch miR-3619-5p konnte mittels Reportergenassays verifiziert werden. Die vorliegende Studie konnte zeigen, dass Autophagie- assoziierte Signalwege in Mykobakterien-infizierten Makrophagen durch die lange nicht-kodierende RNA MEG3 und die miRNA miR-3619-5p beeinflusst werden.