Expression der Endothelin-Rezeptoren und interagierender vasoaktiver Systeme in einem transgenen Rattenmodell mit glattmuskelspezifischer Expression des humanen Endothelin-A Rezeptors

Abstract

In dieser Arbeit wurden die genomische Integration, die Transgen-Expression und die adaptiven transkriptionellen Reaktionen auf RNA-Ebene in einem transgenen Rattenmodell des humanen Endothelinrezeptors Typ A (ETAR) untersucht. Mit diesem Modell sollte die in vivo Funktion des glattmuskellzellspezifisch exprimierten ETAR untersucht werden. Hierfür standen fünf durch pronukleäre Mikroinjektion generierte transgene Rattenlinien zur Verfügung (L6341, L6351, L6888, L6353, L6888). Diese exprimierten den humanen ETAR unter Kontrolle des murinen SM22α Promotors gefäßmuskelspezifisch in unterschiedlichem Ausmaß. Die Identifizierung von Tg- Merkmalsträgern erfolgte durch eine konventionelle genomische PCR. Zusätzlich wurde ein auf der Realtime-PCR basierender Assay zur Quantifizierung der genomisch integrierten Kopien etabliert. Es ließen sich hiermit in Transgen (Tg)-heterozygoten Tieren von L6878 eine Kopie, in L6351 acht Kopien und in L6888 vier Kopien nachweisen. Gleichzeitig war mit diesem Assey die Identifizierung von homozygoten Merkmalsträgern möglich. Auf RNA-Ebene erfolgte die Charakterisierung der Rezeptorexpression in ausgesuchten Gefäßen und Organen durch RT-PCR Untersuchungen. Hierbei zeigten sich bereits ausgeprägte Expressionsunterschiede. Während in L6341 praktisch keine Rezeptorexpression nachweisbar war, ließ sich eine eindeutige Expression in L6351 und L6878 nachweisen. Die anderen beiden Linien lagen in ihrer Tg- Expression dazwischen. Zusätzlich zeigte sich in L6878 auch eine mRNA- Expression in verschiedenen Organen. In L6878 und L6351 erfolgte mittels Realtime-PCR die Quantifizierung der mRNA-Expression des Tg-Rezeptors sowie der endogenen ETAR und ETBR in Mesenterialarterien und Aorten in einen Monat und einen Jahr alten Tieren. Auch hier zeigte sich ein differenziertes Rezeptorexpressionsniveau. Während in den Aorten von L6351 mehr Tg-Rezeptor als in L6878 exprimiert wurde, war in L6878 in den Mesenterialarterien eine deutlich höhere Rezeptorexpression als in L6351 nachweisbar. Insgesamt lag hierbei die mRNA-Expressionsstärke des Tg-Rezeptors in einen Monat alten Tieren auf dem Niveau des endogenen ETAR. In beiden Linien kam es nach einem Jahr zu einer Abnahme der Tg-Expression. Während diese in L6878 jedoch prozentual gering war, ließ sich in L6351 kaum noch Expression nachweisen. In homozygoten Tieren von L6878 war die mRNA-Expression des Transgens im Vergleich zu heterozygoten Tieren derselben Linie verdoppelt. Weiterhin zeigte sich in den Aorten von L6878 in ein Jahr alten Tieren eine signifikant verminderte Expression des endogenen ETAR. Signifikante mRNA- Expressionsänderungen ließen sich für den ETBR in beiden untersuchten Tg- Linien nicht nachweisen. Neben den Anpassungsvorgängen im ET-System zeigte sich im Vergleich mit einer Tg-negativen Kontrollgruppe eine deutlich erhöhte Expression des alpha1B-adrenergen Rezeptors in Mesenterialarterien von einen Monat alten Tieren sowohl in L6351 als auch in L6878. Gleichzeitig war die mRNA-Expression der G-Protein gekoppelten Rezeptorkinase 2 (GRK2) signifikant erhöht. Zusätzlich zeigte sich hierbei eine enge Korrelation der mRNA- Expression von alpha1BR und GRK2 in Tg-negativen und Tg-positiven Tieren. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse bilden die Grundlage für die weitere phänotypische Charakterisierung der transgenen Rattenmodelle und sind damit Ausgangspunkt für die Gewinnung eines tiefer gehenden Verständnisses der ETAR- Funktion in der Gefäßwand. Die hier aufgezeigten Anpassungsvorgänge machen gleichzeitig die Limitationen der konstitutiven transgenen Rezeptorexpression deutlich.

In this thesis we analyzed genomic integration, transgenic-expression and adaptive transcriptional changes on RNA-basis in a transgenic (tg) rat model expressing the human Endothelin-A-receptor (ETAR). Therefore we used 5 different rat strands (L6341, L6351, L6888, L6353, L6888) generated by pronuclear microinjection which expressed the human ETAR under control of murine sm-22alpha promoter for smooth muscle cell specific expression. Identification of transgenic animals was done by conventional polymerase chain reaction (PCR). Furthermore we established a realtime PCR based assay for quantification of transgenic insertion. With this method we determined 8, 4 and 1 tg-copies in tg-heterozygote animals of L6351, L6888 and L6878 respectively. Furthermore we were able to distinguish homozygote and heterozygote transgenic animals. On RNA level we analyzed the transgenic expression of human ETAR in selected organs and vessels with RT-PCR technique. Whereas in L6341 no significant expression was determined, high expression was found in L6878 and L6351. In the other two lines moderate expression was found. Interestingly there was significant tg-expression in the organs of L6878. For further discrimination we used Realtime-PCR to quantify RNA- expression of tg ETAR, endogenous ETAR und ETBR in mesenteric arteries and aorta of L6878 and L6351 in one month and one year old animals. Whereas in aortic RNA of one month old animals higher transgenic expression was found in L6351, there was much higher transgenic expression in mesenteric RNA of L6878 compared with L6351. The transgenic receptor expression was nearly on the same level as the endogenous receptor expression. In one year old animals of both lines a downregulation of transgenic expression was recognized. Whereas by this time in L6351 almost no RNA-expression was detectable, L6878 still expressed significant levels of transgenic RNA. Interestingly in homozygote animals of L6878 transgenic expression was doubled compared to heterozygote animals of the same line. Furthermore endogenous ETAR expression was significant diminished in aortic RNA of L6878 in one year old animals. No expressional changes of endogenous ETBR-expression have been observed in any of the lines. Besides of described adoptions, one month old animals of both lines showed a higher alpha1B RNA expression in mesenteric arteries. In addition a higher expression of G-protein-coupled receptor kinase 2 (GRK 2) was detected in transgenic animals. Furthermore a strong correlation between alpha1BR and GRK2 RNA expression was recognized for transgenic and non- transgenic animals. These findings establish a basis for further phenotypic analysis of the transgenic rat model and provide possibilities for a deeper understanding of the ETAR function in vessels. Meanwhile limitations of a constitutional transgenic animal model become apparent.